冠心病血瘀证相关IncRNA-miRNA-mRNA调控网络研究

背景及目的随着社会经济的发展,人口老龄化进程的加快等,心血管疾病的危险因素水平持续增加,冠心病已成为致死率最高的慢性疾病之一。在我国乃至全球,冠心病发病率和造成的社会经济负担日益增加,对冠心病病理机制的持续探讨并以此进行治疗策略的优化显得极为迫切。在现代中医学理论中,冠心病属于"胸痹"、"心痛"的范畴,血瘀是临床上冠心病心绞痛的最主要证候要素。从瘀血角度探讨冠心病血瘀证的病理发生发展,有助于深层理解冠心病血瘀证。随着近十年组学技术和生物信息学处理技术的高速发展,对冠心病血瘀证证候本质的研究,已进入基因组学、转录组学层面。利用基因组学信息量大、指标客观而层次深、具有网络关联性的特点,可以从多角度深入挖掘冠心病血瘀证证候本质。本研究在既往研究基础上,通过高通量测序筛选冠心病血瘀证相关基因表达谱,以shRNA转染技术验证基因间调控关系,构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,定位该基因调控网络中的关键节点,从转录组学层面对冠心病血瘀证的病理机制和证候本质进行探索,为未来开发冠心病血淤证生物标志物和活血化瘀作用靶点提供客观科学依据。方法1文献研究近40年对中医证型的相关研究,从宏观到微观,从量表研究到实验研究,从以疾病、症状、组织、细胞等为主体,目前已逐渐发展至分子水平、基因水平。检索中国知网、维普网、万方数据、Pubmed和Web of Science数据库,获取中医证型相关基因组学研究(对具体疾病、证型、干预手段无限制)。研究范围包括临床试验、动物及细胞实验,使用基因芯片、高通量测序等组学技术,研究SNP、DNA、mRNA、ncRNA(包括 miRNA、lncRNA、circularRNA)等基因组/转录组学指标。提取纳入研究的出版资料、研究内容(包括研究物种、研究疾病、涉及证型、是否干预)、组学技术(包括检测指标、检测技术、使用技术最大读数、差异判断标准、差异基因个数、是否进行验证、进一步分析方法)以及研究特点进行文献综述研究,总结相关研究趋势,并为本研究的研究思路与方法提供参考。2实验研究使用高通量测序技术,分别检测冠心病血淤证、冠心病非血瘀证和正常对照人群外周血有核细胞中lncRNA、miRNA和mRNA表达情况,使用生物信息学算法筛选出冠心病血瘀证与正常对照、冠心病血淤证与冠心病非血淤证之间的差异表达基因,并使用关联分析,获取冠心病血瘀证相关的lncRNA、miRNA、mRNA表达谱。对获得的差异基因进行聚类分析、主成分分析、GO和KEGG功能通路分析。通过starBase在线靶基因预测数据库和基因测序表达量相关分析,获取基因间调控关系,构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。在另一匹配队列中对基因调控网络中的关键节点进行qRT-PCR验证。使用慢病毒介导的shRNA转染技术,对冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络中关键基因进行干扰,检测其上下游调控节点表达水平,对lncRNA、miRNA、mRNA之间的调控作用及该基因网络进行验证,从转录组调控层面对冠心病血瘀证的证型本质和病理机制进行探索。结果1中医证型相关基因组学研究分析通过检索获得30篇中医证型相关基因组学研究文献,其中中文期刊论文17篇,英文期刊论文13篇,最早发表年份为2005年,最近发表年份为2016年。对纳入的30项研究进行文献综述研究,发现中医证型相关基因组学研究历经十余年,在13种疾病/状态和11种证型中开展,通过基因芯片或高通量测序技术,从DNA/cDNA、mRNA、miRNA、lncRNA和SNP等多个角度对中医证型物质基础、基因表型进行了探索。研究最多疾病为冠心病、脑卒中、乙型肝炎、糖尿病以及衰老;研究最多证型为血瘀证与肾阳虚证(各8项),其次为湿浊中阻证与肝郁脾虚证(各4项)。研究最多指标为mRNA,近年来miRNA或lncRNA联合mRNA进行的研究日益增多。从研究方法与结果来说,中医证型相关基因组学研究目前仍处于发展阶段,如缺乏统一、公认的证型诊断标准或证型造模方法,结果分析仍停留在表层的差异基因筛选,未能进行更深层次的功能分析,未对研究结果进行PCR验证等。中医证型相关基因组学研究在取得一定成果的同时,需要在实验设计、实验方法、研究规划方面提高其合理性、严谨性和科学性,并对研究结果进行深化研究,深入探索差异基因的生物学功能以及作用途径,为中医证型客观化、标准化、探索其物质基础提供科学证据与研究新思路。2冠心病血瘀证丨ncRNA-miRNA-mRNA调控网络研究使用高通量测序技术及生物信息学分析方法,对冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证和正常对照进行两两比较和交联比较,最终获得39个lncRNA(3个上调,36个下调),229个miRNA(138个上调,91个下调)和221个mRNA(105个上调,116个下调)在冠心病血瘀证中差异表达。分层聚类分析和主成分分析显示冠心病血淤证与正常对照、冠心病非血淤证与正常对照之间在lncRNA、miRNA和mRNA均有较明显的差异表达基因谱,lncRNA、miRNA和mRNA可将该3组样本区分,各个样本被正确归类。通过对相关基因进行功能与通路分析,发现冠心病血瘀证差异表达基因主要与免疫和炎症相关,如免疫反应的激活信号转导、γγ-干扰素介导的信号通路、T细胞共刺激、白细胞介导的免疫反应、Toll样受体信号通路等。利用starBase和相关分析获得的基因间互作关系显示,冠心病血瘀证相关差异基因间共有76个调控关系,涉及9个lncRNA(均为下调)、31个mRNA(11个上调,20个下调)和24个miRNA(14个上调,10个下调)。根据此调控关系集构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,经过网络拓扑分析和韦恩分析,3个lncRNA(CTA-384D8.35、CTB-114C7.4 和 RP11-567M16.6)和 1 个 miRNA(hsa-miR-3158-3p)被认为是网络中的关键节点。相同人群队列的qRT-PCR验证支持上述结果。挑选基因调控网络中关键节点(CTA-384D8.35和CTB-114C7.4)和miRNA(miR-3196和miR-3656)进行基因干扰,检测受调控的mRNA(NR4A1、EGR1、IER2和IER3),对冠心病血瘀证基因调控网络进行验证。结果显示该网络中主要存在以下调控方式:①LncRNA上调mRNA的表达;②LncRNA下调部分mRNA的表达水平;③miRNA抑制mRNA的表达;④miRNA亦可促进mRNA的表达;⑤lncRNA和miRNA之间存在双向调控模式;⑥lncRNA-miRNA-mRNA的共调控模式。结论冠心病血瘀证存在lncRNA、miRNA、mRNA差异表达基因谱,相关基因功能与涉及通路多与免疫和炎症反应相关。上述差异表达基因间存在相互调控关系,并可依此构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。RNAi研究证实了 lncRNA、miRNA、mRNA之间的多向、交联、复杂调控模式,验证了该调控网络的真实性。冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络及其中调控关系的探索研究,为冠心病血瘀证的物质基础研究提供一定的科学基础。