禽流感(Avian Influenza, AI)是严重危害畜牧业和人类健康的一种传染病,该病引起禽类的呼吸系统以及全身败血症为特征,多年来在世界许多国家和地区都发生过此病,该病危害严重,造成的经济损失巨大,世界各国都非常重视,对其进行了大量研究。禽流感历来被认为是人流感病毒发生变异的新基因来源,1997年香港H5N1型和1999年内地和香港H9N2型禽流感病毒感染人事件的发生,更突出地显示了禽流感的公共卫生意义。
目前禽流感确切诊断依赖于病毒的分离鉴定、血清学检测以及分子生物学诊断技术以及电镜技术等。血清学诊断方法包括血凝及血凝抑制实验(HA,HI),神经氨酸酶抑制实验(NIT),琼脂糖扩散实验(AGP),病毒中和实验(NT),酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫荧光技术(IFT)等。2004年,通过国家质检总局鉴定,确认荧光RT-PCR法,作为国家检测禽流感新的标准。但这些检测方法由于检测时间较长及检测所需仪器设备较昂贵,多数不适于临床快速检测。因此,新型快速检测禽流感的方法急需建立,本研究利用免疫胶体金层析技术初步实现了对禽流感的快速检测,对禽流感的快速检测具有重要意义。
本研究以哈尔滨兽医研究所提供的H5亚型禽流感油乳剂疫苗长期免疫BALB/c小鼠,取抗体效价较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,融合率为65.8%;建立间接ELISA方法,用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体(McAb),初检阳性率为14.2%;进行多次亚克隆及反复筛选,获得了2株能稳定分泌抗禽流感病毒(AIV)McAb的杂交瘤细胞株,命名为5A6,5G7。将得到的单抗株进行初步鉴定,两株单抗株特异性针对禽流感病毒的共同抗原表位。5A6和5G7杂交瘤细胞株经过反复冻存、复苏及多次传代,均能分泌较高效价抗体,其抗体效价保持在1:1000以上;将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内7天后收集腹水,经辛酸-硫酸铵法提纯后间接ELISA检测其效价达1:32000以上。单抗生物学初步鉴定结果显示,制得的McAb具有亲和力高,特异性强等特点。乳胶凝集试验证实所分泌抗体均属IgG1、k型。本试验获得的McAb将在禽流感的检测及预报中发挥重要作用。
用H5亚型禽流感油乳剂疫苗对山羊进行长期免疫,用间接ELISA方法和琼脂扩散实验(AGP)进行监测,得到了高效价的羊抗AIV多克隆抗体。其效价分别为:ELISA法效价达1:10万以上,AGP法效价在1:8以上。本试验用获得的McAb和多克隆抗体建立了AIV的免疫胶体金层析快速诊断方法。根据试验需求制备了30 nm的胶体金颗粒,对的McAb最适稳
