茶氨酸对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

目的：脑缺血梗死所致神经损伤病理生理机制与损伤级联反应有关,它主要包括：兴奋性毒性(excitotoxicity)、钙超载(calcium overload)、炎症(inflammation)、程序性细胞死亡(PCD)等过程。损伤级联反应都以兴奋性毒性开始,兴奋性毒性不仅引起急性坏死,也启动延迟性细胞死亡,还与缺血后的炎症反应有关。 L-茶氨酸(L-theanine)是茶叶中一种独特成分,近年来关于茶氨酸对于神经损伤的保护作用正受到越来越多的关注。本文旨在通过观察茶氨酸对脑缺血再灌注大鼠中枢神经系统氨基酸类神经递质及相关基因表达的影响来探讨茶氨酸对神经损伤的保护作用机制。 方法： 1.建立反相高效液相色谱荧光法测定大鼠血清、脑组织中茶氨酸和4种氨基酸类神经递质的含量。 采用ODS-SPC18色谱柱(4.6 mm×250 mm,粒径5μm),以磷酸二氢钾缓冲液(0.1mol/L,pH6.0)四氢呋哺：甲醇体积比=62：3：35为流动相；高丝氨酸为内标；邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生；柱温：40℃；流速：0.85 ml/min;荧光检测器激发波长340nm、发射波长455nm,检测大鼠血清、脑组织中茶氨酸和氨基酸类神经递质天冬氨酸(DL-aspartic acid, Asp)、谷氨酸(L-glutamic acid,Glu)、甘氨酸(glycine,Gly)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)含量。 2.茶氨酸对大鼠脑缺血再灌注所致神经损伤的影响 体重90～120gSPF级雄性健康SD大鼠68只,按体重随机分为模型组(Model, n=15)、茶氨酸低剂量组(Th-L, n=15)、中剂量组(Th-M, n=15)、高剂量组(Th-H, n=15)、假手术组(SH,n=8)。低、中、高剂量组大鼠每天灌胃分别给于茶氨酸10、30、90mg/kg.bw,模型组、假手术组灌胃给予等量超纯水。灌胃15天后行MCAO手术,缺血2h后进行再灌注；SH组施予相应假手术。术后禁食24h。分别于再灌注3h、24h后对各组大鼠进行神经功能行为评分；再灌注24h后称量大鼠体重后取脑称量脑湿重,测定缺血侧脑皮质氨基酸类神经递质Asp、Glu、Gly、GABA含量；并采用RT-PCR法检测海马组织中脑源性神经营养因子(BDNF) mRNA以及B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukernia-Bcl-2) mRNA的表达水平。 结果： 1.反相高效液相色谱荧光法测定茶氨酸和4种氨基酸类神经递质含量 茶氨酸浓度在1-20μmol/L范围内标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.9997；浓度为1、10、20μmol/L时日内精密度(RSD%)分别为3.51,1.58,0.75；日间精密度(RSD%)分别为4.54,3.25,2.87；平均回收率范围为91.8%-99.1%；最低检测限为0.02μmol/L。SD大鼠给予200 mg/kg.bw茶氨酸灌胃后,血清中峰值出现在0.5-1.0小时之间,脑组织中浓度在5小时达到峰值。其他4种氨基酸在26min内洗脱完全,分离效果良好；在1～20μmol/L的浓度范围内标准曲线的线性关系良好,其相关系数为天冬氨酸(Asp)：0.9998,谷氨酸(Glu)：0.9998,甘氨酸(Gly)：0.9974,γ-氨基丁酸(GABA):0.9998;4种氨基酸日内RSD(%)范围为0.77～7.54,日间RSD(%)范围为2.49-16.75。 2.茶氨酸对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响 2.1茶氨酸对脑缺血再灌注损伤24h后大鼠神经功能评分的影响：SH组大鼠术后基本无homer体征；各缺血组再灌注3h、24h后均出现不同程度的神经损伤体征,其中茶氨酸剂量组评分均低于Model组(P<0.05)且Th-H组显著低于其他各剂量组(P<0.05) 2.2茶氨酸对脑缺血再灌注损伤24h后大鼠脑指数的影响：Model组大鼠脑指数明显高于SH组(P<0.05),提示脑组织缺血水肿,而各茶氨酸剂量组随着剂量的升高,脑指数随之降低,与Model组比较差异均有显著性(P<0.05)。 2.3茶氨酸对脑缺血再灌注损伤24h后大鼠氨基酸类神经递质的影响：与SH组比较,Model组大鼠皮质兴奋性氨基酸类神经递质Asp、Glu含量显著升高(P<0.05),而茶氨酸各剂量组大鼠皮质Asp含量与Model组相比均降低,且Th-H组显著低于Th-L组(P<0.05)但茶氨酸各剂量组大鼠皮质Glu含量与Model组相比无显著性差异(P>0.05)。Th-M、Th-H组大鼠皮质Gly、GABA含量与Model组相比均显著升高(P<0.05)。大鼠皮质中茶氨酸含量随灌胃剂量的增加而升高。 2.4茶氨酸对脑缺血再灌注损伤24h后大鼠缺血侧海马组织BDNF mRNA、Bcl-2 mRNA表达水平的影响：茶氨酸各剂量组大鼠海马组织BDNF mRNA的表达均显著高于Model组；其中Th-H组还高于Th-M、Th-L组(P<0.05)。茶氨酸各剂量组大鼠海马组织中Bcl-2mRNA的表达均显著高于Model组,茶氨酸剂量组之间,Th-M组显著高于其他两组(P<0.05) 结论： 1.已建立的反相高效液相色谱荧光法灵敏度高,重复性好,能有效分离检测大鼠血清、脑组织中茶氨酸含量。 2.茶氨酸对大鼠脑缺血再灌注引起的神经损伤具有一定的保护作用,其机制与抑制中枢兴奋性氨基酸类神经递质,提高中枢抑制性氨基酸类神经递质含量以及上调BDNF mRNA和Bcl-2 mRNA的表达有关。