三七皂甙成分对脂多糖诱导巨噬细胞炎性因子的影响及其机制的研究

目的： 系统研究三七总皂甙（Panax notoginseng，PNG）及其五个单体成分人参皂甙Rb1、Rg1、Rd、Re和三七皂甙R1的抗炎作用，并且对其抗炎作用进行比较，确定三七总皂甙中起抗炎作用的主要成分，并进一步研究其分子机制。 方法： 1.构建细胞炎症反应模型。用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，使其产生炎症反应。并用Real-time PCR检测炎性因子白介素1-β（interleukins1-β，IL-1β）、白介素6（interleukins-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）和诱导型一氧化氮合成酶（inducible NO synthase，iNOS）的表达情况。 2.利用MTT方法检测三七总皂甙及其五个单体成分Rb1、Rd、Rg1、Re和R1对RAW264.7细胞的细胞毒性并计算其IC50。 3.利用上面的细胞炎症反应模型，对三七总皂甙及其五个单体成分Rb1、Rd、Rg1、Re和R1进行抗炎作用的筛选，实验分组：RAW264.7细胞组，LPS+RAW264.7细胞组，LPS+RAW264.7细胞+皂甙组。对于抗炎作用我们首先检测了三七皂甙成分的不同浓度对炎性因子的抑制情况，浓度设置是12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，然后又检测了不同作用时间（3小时、6小时、12小时和24小时）对IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS炎性因子表达的影响。 4.采用western blot法检测PNG、Rb1、Rd,、Rg1、Re和R1对MAPK信号通路中的磷酸化ERK1/2和总的ERK1/2、磷酸化JNK和总的JNK、磷酸化的p38和总的p38蛋白及NF-κB信号通路中的NF-κB蛋白表达的影响。 5.采用流式细胞术检测PNG、Rb1、 Rd,、Rg1、Re和R1对细胞表面辅助分子CD14和TLR4表达的影响。 结果: 1.利用100ng/mLLPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞后，炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的表达明显升高。 2.当检测三七皂甙成分对RAW264.7细胞的细胞毒性时，我们发现PNG、Rb1、Rd,、Rg1、Re和R1对RAW264.7细胞几乎无毒，其IC50都高于400μg/mL。 3.在进行抗炎作用筛选时，我们发现PNG、Rb1和Rd对IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS四种炎性因子的mRNA表达具有明显的抑制作用，尤其是Rd；而R1对TNF-α和iNOS两种炎性因子的表达具有明显的抑制作用，但是Rg1和Re仅对iNOS炎性因子的表达具有明显的抑制作用，以上对于炎性因子的抑制作用都有浓度和时间依赖性。 4.我们对三七总皂甙及其五个单体成分的抗炎作用机制进行了研究，发现PNG、Rb1、Rd对p-ERK1/2和NF-κB蛋白的表达具有明显的下调作用，并且呈浓度依赖性，对p-JNK和p-p38蛋白的表达则完全抑制，对总蛋白ERK1/2、JNK、p38的表达没有明显影响；Rg1、Re、R1对磷酸化的ERK1/2、JNK、p38及总的ERK1/2、JNK、p38以及NF-κB蛋白表达都没有明显的影响。 5. CD14和TLR4是巨噬细胞膜上LPS的受体，因此我们想研究药物对于LPS的受体是否有影响，就利用流式检测了细胞表面的CD14和TLR4的表达情况，发现加入LPS组和正常组相比较，CD14辅助分子的荧光强度明显升高，TLR4的荧光强度有一定程度的降低；加入三七皂甙成分及LPS组和单独加入LPS组相比较CD14辅助分子的荧光强度明显降低，其降低程度PNG>Rd>Rb1>Re>R1>Rg1，而TLR4荧光强度没有明显的变化。 结论: 我们在体外成功的构建了细胞炎症的反应模型，并且发现三七总皂甙及其五个单体成分Rg1，Rb1，Rd，Re和R1都有一定的抗炎作用，但是这些抗炎作用中Rd的效果最好，其次是Rb1，因此，我们推断三七总皂甙抗炎作用起主要作用的组分有可能是Rd和Rb1。并且对抗炎的信号通路进行研究发现，三七总皂甙以及Rd和Rb1对MAPK通路及NF-κB通路都有很好的下调作用，因此其抗炎作用有可能是通过抑制这些通路来抑制炎性因子的表达。