调控肿瘤细胞IGF-1R信号通路的关键分子研究

癌症是一组细胞恶性增长、增殖失控的不同疾病的统称。目前癌症的治疗主要包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗、基因治疗以及免疫治疗等,但疗效有限。1950年至2005年美国的癌症死亡率仅下降5%,癌症患者3年及5年生存率提高也不明显。究其原因,主要是对癌症的发生发展机制不甚清楚,无法从根本上治疗癌症。引起癌症的原因中90%-95%是环境因素,5%-10%跟遗传有关。常见的引起癌症的环境因素包括烟草(25-30%)、饮食和肥胖(30-35%)、感染(15-20%)、辐射(10%)、压力、缺乏体力活动和环境污染等。 目前认为生长调控基因的改变导致了正常细胞转化为恶性肿瘤细胞。包括：促进细胞的生长和繁殖的基因-癌基因,抑制细胞分裂和存活的基因-抑癌基因。通过形成新的癌基因,不正常的癌基因的过度表达,或抑癌基因表达的抑制可导致恶变发生。通常情况下,一个正常细胞转化为癌细胞需要许多基因的改变,基因改变可以发生在不同层次。较常见的是突变：包括大规模的突变,涉及部分染色体的缺失或增益；小规模的基因突变包括点突变、缺失、插入、可能发生在一个基因的启动子区域,影响其表达,或可能发生在基因的编码序列,并改变其蛋白产物的功能或稳定。 然而随着研究的深入,大家逐渐认识到肿瘤的发生发展远不止上述原因,国际权威杂志《Cell》撰文总结了肿瘤细胞的新十大特征,即：自给自足的生长信号；抗生长信号的不敏感；回避凋亡；潜力无限的复制能力；持续的血管生成；组织浸润和转移；避免免疫摧毁；促进肿瘤的炎症；细胞能量异常；基因组不稳定和突变。 正因为癌症是一类疾病,将永远不可能像感染性疾病一样用单一的治疗方法治愈。血管生成抑制剂一度被认为有潜力的“良方”可用于治疗多种癌症,但在临床实践中,情况并非如此。现在越来越多的癌症研究以个体生物学为基础,开发适合不同个体药物治疗的个体化治疗。癌症研究是一个了解疾病的进程并发现疗法的过程。有关癌症成因的研究主要集中在以下问题上：引起或促进细胞恶变过程中的遗传物质变化的事物(如病毒)和事件(如突变)；基因损伤的机制,以及受其影响的下游基因；基因变化对细胞生物学的影响,包括肿瘤细胞的生成及导致癌症进一步恶化的更多基因改变。通过对肿瘤的分子生物学和细胞生物学认识的提高,新的有效的治疗方法会不断涌现出来。 靶向治疗采用单抗、小分子物质阻断肿瘤发生发展过程中特有信号传导通路,达到治疗肿瘤目的。胰岛素样生长因子受体1(Insulin like growth factor type1,IGF-1R)信号转导通路通过多种机制涉及了肿瘤的发生、有丝分裂、转移、血管发生和抗凋亡等,并涉及了肿瘤化疗的耐药、放疗以及针对HER-2和EGFR的靶向治疗等方面。IGF-1R在许多肿瘤细胞中过表达,而抑制IGF-1R的表达不仅可以终止细胞的转化,还可以逆转细胞的恶变。目前针对IGF-1信号转导通路的研究,主要集中在IGF-1R及其下游,如IGF-1R单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂。针对IGF-1R的单克隆抗体不仅可以阻断配体-受体相互作用,还可以下调受体。受体的下调作用比阻断配体-受体相互作用在治疗中的意义更重大目前已经开发出来的针对IGF-1R的抗体主要包括IMC-A12, MK0646,AMG-479,AVE-1642以及CP-751871等,体内和体外实验均显示出广泛的抗肿瘤效果。2009年ASCO会议报道的CP-751871与紫杉醇化疗方案联合治疗晚期转移性NSCLC的Ⅱ期临床试验的结果提示该药与传统化疗药物联合应用的前景。IGF-1R单克隆抗体CP-751871的Ⅱ期临床研究的结果证实其对局部晚期和转移性NSCLC患者的一线治疗的安全性和有效性,IGF-1R单克隆抗体可能会对NSCLC特别是肺鳞癌的治疗提供一个新的治疗选择,现有的几种靶向药物对肺鳞癌患者治疗效果不理想。然而,在随后的CP-751871治疗NSCLC的Ⅲ期临床试验发现,接受该药物治疗的NSCLC患者并不比只接受标准疗法的患者活得更长,因此该药的临床试验被迫终止。这使得我们有必要进一步探究IGF-1R靶点的作用机制以及新的治疗靶点与方法。 本课题将深入研究IGF-1R信号通路调控的关键因子,进一步明确IGF-1R信号通路在肿瘤细胞中的作用,调控该信号通路的关键分子及其作用机制。另外,本课题还将研究IGF-1R抑制剂包括单克隆抗体与小分子抑制剂的作用机制,及改善抑制剂疗效的药物与方法。从而为靶向IGF-1R研究提供理论支持,为预测肿瘤靶向治疗反应提供分子标记物,改善肿瘤靶向IGF-1R治疗中存在的问题。 第一部分G蛋白偶联受体激酶的选择性募集调控IGF-1R信号转导及受体转运 [研究目的] (1)明确G蛋白偶联受体激酶(GRKs)在IGF-1R信号通路中的作用。 (2)探讨不同GRK介导不同IGF-1R下游信号通路的作用机制。 [研究方法] (1)质粒转染及RNA干扰技术分析蛋白之间的相互作用。 (2)免疫共沉淀检测蛋白相互结合情况。 (3) SDS-PAGE及Western蛋白印迹分析蛋白表达。 (4)激光共聚焦显微镜直观观察蛋白分子之间的相互作用。 (5)荧光共振能量转移在活细胞实时检测beta-arrestins同IGF-1R的结合情况。 (6)实时荧光定量PCR (qReal-time PCR)技术检测基因mRNA的表达情况。 [结果] (1)筛选：GRKs对IGF-1激活ERK/AKT信号通路的抑制作用。GRK2抑制IGF-1诱导的ERK活化,而GRK6可延长ERK的活化。 (2)验证：GRK2与GRK6影响IGF-IR表达。GRK2可使IGF-1R免于降解,而GRK6则加快IGF-1R的降解。 (3)功能验证：IGF-1R是GRKs作用的底物。过表达GRK2后,HEK293T和BE细胞的IGF-1R丝氨酸磷酸化水平明显升高；在过表达GRK6的HEK293T中,IGF-1R丝氨酸磷酸化在配体作用下也有升高,而在BE细胞中,无论是否受配体IGF-1的刺激,GRK6的过表达都明显增加IGF-1R的丝氨酸磷酸化。 (4) β-arrestinl募集至IGF-1R受GRK调控。过表达GRK2可使β-arrestinl同IGF-1R的结合明显增多,但解离快；但是,过表达GRK6可引起p-arrestin1/IGF-1R显著而持续的结合。 siRNA干扰GRK2后可显著减少IGF-1R的泛素化,GRK2的过表达却可明显增加受体的泛素化；同样,抑制GRK6也可减少受体泛素化,GRK6的高表达可增加受体基础泛素化水平。 (5)确定GRK介导的磷酸化丝氨酸残基位点。IGF-1R C端1248位丝氨酸(S1248)的磷酸化同GRK2过表达类似,都可使IGF-1R/β-arrestin1短暂结合,促使Class A受体反应,而IGF-1R C端1291位丝氨酸(S1291)的磷酸化同GRK6过表达相似,可使IGF-1R/β-arrestin1稳定结合,即ClassB受体反应。 (6)丝氨酸突变对受体降解的作用。S1248突变引起的IGF-1R降解同GRK2表达量的变化类似：S1248D(IGF-1R C端1248位丝氨酸突变为天门冬氨酸)同GRK2过表达,S1248A(IGF-1R C端1248位丝氨酸突变为丙氨酸)同GRK2低表达。同样,S1291的突变模拟了GRK6的变化：S1291A等同于GRK6表达抑制,S1291D等同于GRK6过表达。 [结论] GRKs可作用于IGF-1R的C端的丝氨酸残基,不同的GRK催化不同位点的丝氨酸磷酸化。GRK2的作用位点是IGF-1R C端的1248位的丝氨酸；GRK6的作用位点是IGF-1R C端的1291位的丝氨酸。不同位点丝氨酸的磷酸化可导致β-arrestin1不同的结合类型,激活的下游信号通路也不尽相同：1248位丝氨酸的磷酸化可使β-arrestin1短暂结合,导致ERK的短暂活化,可使受体循环利用；而1291位丝氨酸的磷酸化可使ERK持续活化,导致受体的降解。上述GRKs在IGF-1R中的作用,同其在GPCR中的作用类似,从而使我们重新认识IGF-1R,其不仅是酪氨酸激酶受体,同时可像GPCR一样被GRK激活丝氨酸磷酸化,激活下游的信号通路。 第二部分IGF-1R抑制剂下调受体的分子机制研究 第一节IGF-1R人源化单克隆抗体的作用及其机制研究 [研究目的] (1)探讨IGF-1R单克隆抗体CP-751871是否引起受体下调,及明确其作用途径。 (2)探讨CP-751871引起受体泛素化的作用机制。 [研究方法] (1)质粒转染及RNA干扰技术分析蛋白之间的相互作用。 (2)免疫共沉淀检测蛋白相互结合情况。 (3) SDS-PAGE及Western蛋白印迹分析蛋白表达。 (4)生物发光共振能量转移在活细胞实时检测IGF-1R泛素化的情况。 [结果] (1)IGF-1可激活IGF-1R下游信号及受体泛素化。IGF-1可激活IGF-1R下游的信号通路,50ng/ml IGF-1刺激5mMin后可使ES1, RDES, LAP35与SKNMC细胞的IGF-1R,Akt及ERK蛋白磷酸化,而在受体阴性的SKBR3细胞未见上述蛋白的磷酸化。 在ES1, RDES, LAP35及SKNMC细胞中,IGF-1R均有不同程度的泛素化,而在受体阴性的SKBR3细胞未检测到泛素化。 (2)CP-751871与IGF-1激活的信号通路的比较。CP-751871同IGF-1激活的IGF-1R的下游信号通路存在很大差异：在ES1,RDES, LAP35与SKNMC细胞中IGF-1均可激活受体的酪氨酸磷酸化以及下游两条重要信号通路蛋白Akt与ERK的磷酸化,而CP-751871仅能在ES1细胞中使ERK磷酸化。 (3)CP-751871可使IGF-1R泛素化及降解。CP-751871比IGF-1对IGF-1R的降解作用更有效；IGF-1R可被IGF-1和CP-751871泛素化,但是,CP-751871作用更强；在泛素化的细胞中可见β-arrestin1同IGF-1R不同程度的结合。 (4)48位赖氨酸连接的泛素化在CP-751871介导的IGF-1R泛素化中发挥重要作用。ES1,LAP35与SKNMC细胞中,IGF-1可诱发48和63赖氨酸连接的受体泛素化,最大值在5到10mins。然而,CP-751871在LAP35细胞中,仅能引发48位赖氨酸连接的受体多泛素化。虽然其在ES1和SKNMC细胞中,可诱发48和63位赖氨酸连接的受体多泛素化,但是63位赖氨酸连接的受体多泛素化较弱且消失较快。 我们应用BRET1检测了IGF-1与CP-751871处理后β-arrestin1/IGF-1R结合情况。如图5所示,ES1细胞中IGF-1刺激后可见β-arrestin1的结合,这同我们观察到的其泛素化程度较SKNMC与LAP35细胞较高相一致；而CP-751871处理的细胞中,LAP35细胞的β-arrestinl结合较多,这也同泛素化检测结果相吻合。 [结论] (1)IGF-1R的单抗CP-751871通过诱导其泛素化下调受体。 (2)CP-751871介导的IGF-1R泛素化的主要类型是48位赖氨酸连接的泛素化。 (3) β-arrestin1参与了CP-751871引起的受体下调及泛素化。 第二节sunitinib泛素化下调IGF-1R的作用研究 [研究目的] 探索sunitinib在IGF-1R细胞信号转导通路中的作用效应,重点是在受体磷酸化和泛素化两方面。 [研究方法] (1)流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。 (2) SDS-PAGE及Western蛋白印迹分析蛋白表达。 (3)MTT法分析细胞增殖与药物毒性。 [结果] (1)IGF-1激活IGF-1R信号通路,可引起明显的IGF-1R、Akt和ERK的磷酸化；然而,IGF-1R、Akt和ERK的磷酸化受到sunitinib显著的抑制。 (2) sunitinib可以显著下调IGF-1R的表达,引起受体泛素化。HEK293细胞系无血清培养24h后应用100ng/ml IGF-1或者10nM sunitinib处理10min,与对照组(只有无血清培养,无其他相关试剂处理)相比,IGF-1和sunitinib可以显著引起受体泛素化,提示IGF-1和sunitinib通过泛素依赖蛋白酶体通路增加受体降解,从而下调受体表达。 (3)在sunitinib刺激下,MDM2可以结合IGF-1R。分别应用HA-MDM2高表达MDM2(+MDM2)和siRNA沉默MDM2(-MDM2),无血清培养HEK293细胞24h后应用10nM sunitinib处理10min。与对照组相比,过表达MDM2细胞系IGF-1R受体泛素化程度增加,而在MDM2缺失表达细胞系中并未发现受体泛素化现象。这些结果显示sunitinib可引起IGF-1R泛素化,该泛素化依赖MDM2。 [结论]sunitinib可阻断IGF-1R信号转导并且介导其降解,而降解依赖于MDM2介导的泛素化作用。 第三部分p53-MDM2信号通路同IGF-1R信号通路的关系研究 [研究目的] (1)明确p53野生/突变型对IGF-1R单克隆抗体CP-751871敏感性的影响。 (2)明确p53野生/突变型在nutlin-3a增敏紫杉醇中的作用。 [研究方法] (1)流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。 (2) SDS-PAGE及Western蛋白印迹分析蛋白表达。 (3) AlamarBlue及MTT法分析细胞增殖与药物毒性。 [结果] (1)我们应用AlamarBlue检测了p53基因型不同的ES1, RDES, LAP35与SKNMC细胞系对CP-751871的敏感性。发现野生型p53的LAP35细胞对CP-751871最敏感,而p53缺失的SKNMC细胞最耐受。而且我们应用MDM的拮抗剂Nutlin-3a处理细胞后发现,仅在LAP35细胞中Nutlin-3a同CP-751871具有协同作用,可提高CP-751871的疗效约20%。 (2) Nutlin-3a可保护野生型p53细胞免受紫杉醇的细胞毒作用,但却对p53缺失的H1299细胞无作用。细胞增殖实验也表明,Nutlin-3a可减低野生型p53细胞对紫杉醇细胞毒作用的敏感性,但却对p53缺失的H1299细胞无影响。 [结论] (1)表达野生型p53的细胞对IGF-1R单克隆抗体CP-751871更敏感。 (2) Nutlin-3a介导的紫杉醇的细胞毒作用,依赖于p53的状态。对于野生型的p53细胞,Nutlin-3a降低了分裂期细胞毒化疗药物的敏感性。在选择化疗辅助药物时应足够谨慎,真正实现个体化治疗。