牙髓干细胞分离培养鉴定和体外诱导分化的研究

牙髓干细胞的研究是目前牙髓生物学领域一个崭新的课题，它对认识牙髓损伤修复机理、探索新的保存牙髓治疗技术具有重要的意义。本研究着眼于小鼠牙髓干细胞分离、培养、鉴定的实验研究，为研究牙髓干细胞体外定向诱导分化创建可靠的实验模型。并初步探讨Notch信号在牙髓干细胞中的生物学功能。 我们成功地从小鼠牙髓组织中培养获得牙髓干细胞，进一步分析结果显示：1)牙髓干细胞有增殖快的特点，细胞呈集落状生长，集落形成率为1.6-2.5／10～4个细胞。2)H．E．染色，见细胞有体小、核大的特点，有较多的双核细胞，细胞间的界限不清。3)碱性磷酸酶染色阳性。4)细胞表型组化鉴定Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、Osteonectin、Osteopontin、FGF-2、BSP染色阳性，而DSPP染色阴性。5)端粒酶 第口旱巨大卿馋士学正枯文 活性分析结果，牙髓干细胞与肿瘤细胞有着本质上的区别，为非永生 性细胞，且端粒酶活性随着体外培养时间延长而降低。6）电镜观察牙 髓干细胞间存在细胞连接，在一定程度上说明细胞间有着较复杂的信 号通讯方式，并影响着牙髓干细胞的增殖与分化。 本课题对获得的小鼠牙髓干细胞进行了体外诱导分化实验。用 BMP》TGF－e、FGF等细胞因子对牙髓干细胞体外诱导8天DSPP In－RNA的表达，用 RT－PCR分析，结果表明有 DSPP InRNA的表达， 提示成牙本质细胞的分化成熟是牙髓干细胞和前体细胞增生并沿着 一定方向分阶段分化的结果。DSPP是终末分化的成牙本质细胞的特 征蛋白，说明牙髓干细胞可在BMPZ、TGF－p、FGF细胞因子诱导作 用下，有向成牙本质样细胞分化的趋势。同时观察到细胞间信号NOtCh 在牙髓干细胞中有表达，为研究N。tCh信号对牙髓干细胞的增殖的影 响奠定基础。 为了进一步研究NOtCh信号途径在牙髓干细胞分化过程中的作 用，我们拟利用N。tch途径关键转录因子RBP－J条件性基因剔除小鼠， 分析NmCh信号途径阻断后牙髓干细胞分化的变化。因此，我们构建 了表达Cre基因的逆转录病毒载体，获得表达有Cre的病毒上清，并 尝试着感染N。t。h－RBP－J条件敲除小鼠的牙髓干细胞，结果显示牙髓 干细胞的N。tCh信号途径阻断后，细胞的增殖受到一定程度的抑制， 提示N扯Ch信号途径可能参与了牙髓干细胞的分化。