小冠花抗L-羟基脯氨酸（Hyp）变异系离体筛选及其耐盐性研究

本研究以小冠花（Coronilla varia L.）子叶来源的愈伤组织为材料,经叠氮化钠（NaN3）诱变处理后,以脯氨酸类似物L-羟基脯氨酸（Hyp）为筛选剂,通过直接筛选培养,获得了3个过量累积游离脯氨酸的Hyp抗性细胞系（Xr1,Xr2和Xr3）。经体细胞胚胎发生途径,高频率再生大量植株。抗性生长试验证明,抗性系愈伤组织、再生植株及其有性、无性后代耐盐（NaCl）性明显增强。生理生化特性分析表明,抗性系较对照系游离氨基酸特别是游离脯氨酸含量显著增加,脯氨酸合成关键酶P5CS活性增强,降解酶PDH活性降低:Na+累积少,K+选择性吸收能力强,细胞内K+/Na+比例高;抗氧化系统SOD和POD酶活性高,细胞膜相对透性小,膜脂过氧化产物（丙二醛）含量低。SDS-PAGE凝胶电泳显示变异系出现新蛋白组分,分子量为24KD。RAPD多态分析表明,抗性系基因组DNA分子水平发生了变化。其主要结果如下: 1.建立了小冠花高效体细胞胚胎发生和植株再生体系。10 d龄无菌苗子叶在附加2.0 mg/L 2,4-D,0.5 mg/L KT的MS培养基上100%诱导出松软愈伤组织,并于含有1.0 mg/L 2,4-D,1.0 mg/LNAA,0.5 mg/L KT和300 mg/L脯氨酸的MSB培养基上培养35天后,形成大量体细胞胚,其数量高达625个/克。在附加1.0mg/L KT、0.1 mg/L IBA和300 mg/L脯氨酸的培养基上体胚发育成植株的平均数约为21棵/克。 2.采用固定诱变剂浓度,变换处理时间的方法,确定了诱变处理愈伤组织适宜的半致死剂量为0.5%NaN3（pH5.4）处理1小时45分钟。 3.用直接筛选法,从诱变处理的550块愈伤组织中,最终筛选出3个抗50mmol/L（全致死剂量）L-羟基脯氨酸（Hyp）的变异体,选择效率为0.545%。经无胁迫条件扩增后,在附加1.0 mg/L2,4-D,1.0 mg/LNAA,0.5 mg/LKT和300mg/L脯氨酸的MSB培养基上形成大量体细胞胚并再生植株。 4.抗性生长试验表明,抗性系具有较高的耐盐（NaCl）性,并且耐盐性能够在再生植株有性、无性后代中传递。以愈伤组织相对生长率为指标,Xr1、