银屑病是在特定遗传背景的人群中,在以感染、应激等为主的作用下,通过天然免疫系统活化进一步诱发自身免疫性T淋巴细胞级联反应引起的。趋化因子CCL20异常表达,导致分泌IL-17的T细胞(T17细胞)激活并迁移,使T细胞与角质细胞(KC)间相互诱导,相互促进,形成恶性循环,导致银屑病皮损炎症反应持续存在。银屑病血热证表现为血分"毒热互结",治以凉血解毒法,凉血解毒方是其有效方剂。青黛,是凉血解毒中药的代表之一,靛玉红是青黛的主要有效成分之一。本课题将整体实验与细胞实验结合,选择凉血解毒方及凉血解毒中药的代表青黛的主要成分靛玉红进行干预,观察银屑病血热证患者皮损和小鼠银屑病样模型皮损CCL20表达,并结合CCL20外部注射和CCL20拮抗剂对银屑病样皮损模型的调节情况,明确CCL20在银屑病发病中的作用。在此基础上,针对这个KC分泌CCL20与T17细胞分泌IL-17A这两个环节,采用凉血解毒方及凉血解毒中药的代表青黛的主要成分靛玉红对其进行干预。同时通过体外研究,深入探讨凉血解毒方对KC分泌CCL20及其信号转导通路的调节作用,以及靛玉红对T17细胞的迁移和分泌的调节作用,进一步明确作用靶点。综合以上研究结果,阐明解毒中药治疗银屑病的可能作用机制。实验一趋化因子CCL20在银屑病皮损中的表达及作用目的:观察CC趋化因子配体20(CCL20)在银屑病皮损中的表达及作用。方法:采用免疫荧光观察银屑病患者及咪喹莫特诱导银屑病样小鼠皮损中CCL20和IL-17A,γδT细胞的表达。采用胶带剥脱诱导小鼠银屑病模型,用银屑病皮损面积和疾病严重程度(psoriasis area and severity index,PASI)评分标准,观察CCL20蛋白注射后银屑病样小鼠皮损的变化;显微镜下观察皮损组织形态学变化,测量表皮层垂直厚度。采用咪喹莫特诱导小鼠银屑病模型,用PASI评分标准,观察CCL20单克隆抗体注射对银屑病样小鼠皮损的影响,显微镜下观察皮损组织形态学变化,测量表皮层垂直厚度;免疫组化观察表皮增殖的变化;ELISA观察细胞上清中CCL20的分泌;real-time PCR检测组织样本中CCL20的表达。结果:银屑病患者及咪喹莫特诱导银屑病样小鼠皮损中CCL20的表达增加;CCL20蛋白复合胶带剥脱组(CCL20组)小鼠银屑病样皮损程度较重,红斑、鳞屑、浸润以及表皮增厚程度高于单纯胶带剥脱模型组;CCL20单克隆抗体组(Anti-CCL20组)小鼠银屑病样皮损程度较轻,红斑、鳞屑、浸润,表皮增厚以及表皮细胞增殖程度轻于咪喹莫特模型组,皮肤组织CCL20的表达明显低于模型组。模型组小鼠皮损真皮中IL-17A,γδ T细胞的表达升高,趋势与皮损中CCL20的表达一致。在体外实验中,IL-17A,IL-22对角质细胞分泌CCL20有一定的诱导作用。结论:CCL20在银屑病皮损中呈高表达,CCL20蛋白可加重胶带剥脱诱导小鼠银屑病样皮损,CCL20单克隆抗体注射对IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损有一定的治疗作用。模型组小鼠皮损真皮中IL-17A,γδ T细胞的表达升高,与皮损中CCL20的表达呈正相关。在体外,IL-17A,IL-22对角质细胞分泌CCL20有一定的诱导作用。实验二凉血解毒汤对人表皮角质形成细胞CCL20表达及分泌的影响目的:观察凉血解毒汤对人表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)CC趋化因子配体20(CCL20)表达及分泌的影响,并探讨其作用机制。方法:用IL-17(100ng·mL-1)刺激HaCaT细胞,并加入不同浓度凉血解毒汤提取物(8μg·mL-1,2μg·mL-1,0.5μg·mL-1),干预体外培养HaCaT细胞模型。采用MTT法检测凉血解毒汤提取物对HaCaT细胞活性的影响;ELISA检测细胞上清CCL20蛋白的含量,Western blot检测细胞内CCL20相关蛋白(p-IκBα、p-P65)的变化,Real-time PCR检测细胞样本中CCL20相关基因(Piasy、trim32mRNA)转录水平的变化情况。结果:IL-17能够诱导HaCaT细胞CCL20的表达及分泌。加入凉血解毒汤水煎剂粉末后,CCL20在分泌、蛋白、mRNA表达水平均明显下降(P<0.05),NF-κB通路相关蛋白p-P65、p-IκBα磷酸化水平显著下降(P<0.01),但对CCL20相关调节分子Piasy、Trim32mRNA的表达无显著影响(P>0.05)。结论:凉血解毒汤提取物通过调节NF-κB通路磷酸化抑制HaCaT细胞分泌及表达CCL20可能是其发挥治疗银屑病作用机制之一。实验三靛玉红对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型的干预作用目的:靛玉红(Indirubin,IR)是从凉血解毒中药青黛的主要成分之一,已被广泛用于治疗炎症和自身免疫性疾病。银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病,γδT细胞在其中发挥了重要作用。本研究为证明靛玉红在银屑病炎症过程中的免疫调节作用和进一步机制探索。方法:BALB/c小鼠背部剃毛,随机分为空白组(CTRL),模型组(Model),靛玉红高剂量组(50 mg/kg),靛玉红中剂量组(25 mg/kg),靛玉红低剂量组(12.5 mg/kg),MTX组(1 mg/kg)。每日涂抹5%咪喹莫特乳膏42mg,观察银屑病样小鼠模型皮损及PASI评分变化;采用HE染色观察皮损的组织学变化;免疫组织化学法检测表皮角质形成细胞增殖程度(PCNA)和皮损中CD3+T淋巴细胞浸润程度免疫荧光法观察银屑病样小鼠皮损中CCL20,Ki67,IL-17A,CD11b,γδT的表达;流式细胞术检测咪喹莫特诱导小鼠引流淋巴结及脾细胞中CCR6、γδ T细胞比例的改变;RT-PCR和Western Blot方法检测皮损中CCL20mRNA,IL-1mRNA,IL-4mRNA,IL-6mRNA,IL-10mRNA,IL-23 P40 mRNA,IL-17AmRNA和IL-22mRNA和JAK3/STAT3信号通路相关蛋白表达。结果:靛玉红改善角质形成细胞的增殖程度,降低CD3+T,γδT,CD11b细胞在银屑病皮损中的浸润,减少CCL20在小鼠银屑病样皮损中的表达,改变γδ T和CCR6+γδT细胞在脾脏和淋巴结中的比例,抑制银屑病样小鼠模型皮损中 IL-1mRNA、IL-6mRNA,IL-23 p40 mRNA,IL-17AmRNA 与 IL-22 mRNA 的表达水平与信号通路JAK3/STAT3相关蛋白的表达。结论:靛玉红通过减少炎性细胞浸润和炎症细胞因子的表达,改善咪喹莫特诱导的银屑病样炎症,这可能是通过JAK3/STAT3信号通路抑制T17细胞介导的免疫反应。实验四靛玉红对人角质形成细胞CCL20分泌及表达的调节作用目的:实验三已经证实靛玉红可以调节咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型皮损中IL-17A的表达,而分泌IL-17的T细胞的迁移至皮损区域主要由趋化因子CCL20异常表达导致。本实验拟在实验三的基础上,进一步观察靛玉红直接对角质形成细胞CCL20表达的调节作用,以期明确靛玉红的作用靶点。方法:用 IL-17A(100 ng ·mL-1)或 IL-22(100 ng·mL-1)刺激 HaCaT 细胞,并加入不同浓度靛玉红(16μM,8μM,2μM),干预体外培养HaCaT细胞模型。采用CCK-8法检测靛玉红对HaCaT细胞活性的影响;ELISA检测细胞上清CCL20的分泌,Real-time PCR检测不同细胞模型细胞样本中CCL20 mRNA转录水平的变化情况。结果:IL-17A,IL-22均能够诱导HaCaT细胞CCL20的表达及分泌。加入不同浓度的靛玉红后,CCL20在分泌和mRNA表达水平均明显下降(P<0.05)(P>0.05)。结论:靛玉红抑制HaCaT细胞分泌及表达CCL20。实验五靛玉红对γδT细胞分泌IL-17的干预作用目的:实验三证实靛玉红可以改善咪喹莫特诱导银屑病样小鼠皮损,减少炎症细胞浸润,调节皮损γδT细胞IL-17的分泌表达。本研究拟在实验三的基础上,进一步观察靛玉红对体外培养的γδT细胞分泌和表达1L-17A的影响,以期明确靛玉红的作用靶点。结果:与γδT induced condition组相比,靛玉红2μM对γδ T分泌的IL-17A有显著影响(P<0.05);与空白组相比,诱导组IL-17AmRNA的表达升高5倍;与诱导组相比,靛玉红组IL-17AmRNA的表达则下降。模型组中IFN-γmRNA表达下降。与正常组相比,induced condition组p-STAT3、p-JAK3表达显著升高1倍;与模型组相比较,靛玉红组p-STAT3、p-JAK3磷酸化水平有所下降。结论:本研究成功从C57BL/6小鼠分选出γδ T细胞。靛玉红对体外IL-17A的分泌及表达有抑制作用,可能是通过抑制JAK3/STAT3信号通路磷酸化而实现的结语综上所述,CCL20参与银屑病发病,在银屑病皮损中呈高表达,注射CCL20蛋白在角质形成细胞受损的情况下可加重皮损区炎症反应,而注射CCL20单克隆抗体对IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损有一定的治疗作用。调整CCL20的稳态可能是通过抑制T细胞向皮损区的募集及迁移达到治疗银屑病的作用。细胞实验进一步证实凉血解毒方通过调节NF-κB通路磷酸化抑制HaCaT细胞分泌及表达CCL20可能是其发挥治疗银屑病作用机制之一。但是我们没有发现凉血解毒方对CCL20表达相关调节分子Piasy、Trim32的影响。凉血解毒中药的代表青黛主要成分靛玉红通过抑制角质形成细胞分泌及表达CCL20,抑制IL-17的分泌和表达,减少T17细胞向皮损及皮肤引流淋巴结的迁移,从而达到改善银屑病样小鼠皮损的目的。这可能是凉血解毒中药临床治疗银屑病的作用基础。
