大鼠TGF-β3基因的克隆及其对肝星状细胞TGF-β1和I型胶原合成的影响

第一部分大鼠转化生长因子-β3基因的克隆及其在肝星状细胞中的表达 目的:克隆大鼠TGF-β3基因并观察其在转染肝星状细胞株（HSC-T6）后的表达情况。 方法:采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从大鼠成骨细胞中扩增出特异性片段,经酶切鉴定证实为大鼠TGF-β3cDNA,将此片段插入pcDNA3.1（+）表达载体,构建得到pcDNA3.1（+）-TGF-β3重组质粒。应用阳离子脂质体介导的基因转移技术将TGF-β3表达载体导入HSC-T6,在转染24h、48h、72h后,用荧光定量PCR法进行瞬时表达的检测。 结果:①重组真核表达载体pcDNA3.1（+）-TGF-β3经限制性内切酶NheI、XbaI酶切,电泳后显示1.2kb的TGF-β3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1（+）载体片段,经测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGF-β3序列相同,证实pcDNA3.1（+）-TGF-β3真核表达载体构建成功;②pcDNA3.1（+）-TGF-β3转染HSC-T6后,24h、48h、72hTGF-β3 mRNA的表达较空白组及对照组增高,以48h增高最为明显（P<0.05）。 结论:重组TGF-β3真核表达载体构建正确,并在转染HSC-T648h后可获得高效表达,为转基因治疗纤维化疾病提供了实验依据。 第二部分转化生长因子-β3对肝星状细胞TGF-β1、I型胶原合成的影响 目的:观察大鼠TGF-β3基因对肝星状细胞株（HSC-T6）TGF-β1和I型胶原合成的影响。 方法:构建TGF-β1表达质粒(pcDNA3.1（+）-TGF-β1)。通过脂质体介导的方法,将pcDNA3.1（+）-TGF-β1转染体外培养的HSC-T6,经G418筛选建立高表达TGF-β1的HSC-T6细胞克隆,一月后荧光定量PCR及Western blot法鉴定。用pcDNA3.1（+）-TGF-β3转染该细胞,荧光定量PCR检测转染48h后TGF-β1、I型胶原mRNA的表达,Western blot法检测TGF-β1、I型胶原蛋白的表达情况。 结果:转染大鼠pcDNA3.1（+）-TGF-β1质粒的克隆细胞,其TGF-β1mRNA及蛋白表达较空白组及对照组明显增高（P<0.05）;I型胶原mRNA及蛋白表达亦明显增高（P<0.05）。TGF-β3基因转染克隆细胞后,TGF-β1mRNA表达与克隆组相比无明显改变,而蛋白表达明显降低（P<0.05）,I型胶原mRNA及蛋白表达较克隆组明显降低（P<0.05）。 结论:TGF-β3基因转染高表达TGF-β1的HSC-T6细胞后,通过降低TGF-β1的合成,从而抑制I型胶原的产生,提示TGF-β3为抑制肝纤维化发展的细胞因子之一。