耐力训练影响ApoE-/-小鼠炎症因子表达与AS防治机制研究

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是严重危害人类健康的疾病之一。当前,以AS为病理基础的心、脑血管疾病的发病率和死亡率均居各种疾病前列。研究AS的发病机理及其防治手段成为医学领域研究的热点和重要课题。一般认为,AS的发生发展是多种遗传因素和环境因素相互作用的结果。近年研究显示,AS是血管内皮损伤后的一种高度特异性的慢性炎症反应过程,炎症是AS中一个关键的致病机制。因此,抗炎治疗有望成为AS新的防治手段。 运动锻炼作为AS综合防治中的重要干预手段之一是运动医学领域极为关注的课题。在运动医学领域虽早已开展相关研究工作,但多为整体、器官水平的研究。已有研究证实,有氧运动对AS形成具有明显的干预效果,但对其机制的研究尚显不足。目前尚未见到有关运动干预AS炎症反应机制方面的研究报道,并缺乏运动对已经形成的AS的治疗或改善作用的相关研究。运动锻炼抗阻AS病理进程的机制尚缺乏足够的实验与理论依据。 目的:本研究以参与AS炎症反应调控的核转录因子-κB（NF-κB）及其诱导的炎症因子表达在AS中的作用为主线,深入探讨运动对AS的干预效果。在复制实验动物AS模型的基础上,采用病理学、生物化学及分子生物学等研究方法及相关技术,从运动影响AS炎症反应角度探讨运动对AS的干预作用,并从分子水平进一步阐明运动防治AS的可能机制。 方法:选取8周龄ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠48只,饲以“西方类型”膳食,随机分为AS预防组（14周实验组）和AS治疗组（26周实验组）,即:14周AS模型组（H组）、14周跑台运动组（HE组）,26周AS模型组（HH组）、14周造模+12周跑台运动组（H+E组）;并选取8周龄同品系C57BL/6J小鼠24只作为对照组,随机分为14周对照组（N1组）和26周对照组（N2组）。每组12只,雄性。令HE组和H+E组小鼠在动物活动跑台上进行耐力性运动（13m/min,60min/次,每周5次）,分别用于观察耐力运动对AS形成的预防作用和运动对已经形成的AS的治疗或改善效果。 在实验过程中每周测量小鼠体重的变化,并观察其生长状况、饮食量、精神状况及对运动负荷的适应能力等。实验周期结束后,采取眼球摘除法从小鼠眼眶静脉丛采集血液标本,用于测定血脂和氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）水平;并取心脏及主动脉近心端1-1.5cm组织制备主动脉根部冰冻切片,从主动脉瓣尖出现起作连续横切,切片厚度7μm。每间隔10张取1张,分别用于油红0染色、HE染色、原位杂交及免疫组化分析等。 采用常规生化检测法测定血脂水平;采用双抗夹心酶联免疫ELISA法测定OX-LDL水平;主动脉根部冰冻切片行油红0染色,通过计算机图像分析系统评估AS斑块面积;主动脉切片行HE染色光镜下分析主动脉组织病理变化;主动脉切片行原位杂交法测定主动脉NF-κBmRNA表达;主动脉切片行免疫组化法测定主动脉NF-κBp65及相关炎症因子的表达等。通过对主动脉AS斑块面积进行定量评估和组织病理分析,并结合OX-LDL对NF-κB的激活及其诱导的炎症因子表达和相关分析,从分子水平上深入研究与阐明运动防治AS的可能机制。 结果: 1、ApoE-/-小鼠生长状况及体重的变化 实验过程中各组小鼠体重均呈稳步增长,实验动物生长发育正常,运动组小鼠对运动负荷适应良好。 2、耐力训练对ApoE-/-小鼠AS形成及主动脉组织病理形态学的影响 ①耐力训练对ApoE-/-小鼠主动脉AS形成的干预效果 与正常对照组(C57BL/6J)小鼠比较,22周龄ApoE-/-小鼠（H组）主动脉根部血管内膜上可见到大量被染成鲜红色的AS斑块,斑块面积占血管腔总面积的41.79±6.93%;耐力运动组（HE组）主动脉根部亦可见AS斑块,但与H组比较,其斑块面积显著减小,斑块面积占血管腔面积比例为25.07±7.94%（P＜0.01）。主动脉切片经HE染色光学显微镜观察病理特征显示,H组小鼠主动脉可见许多脂纹-纤维斑块期病变和少量粥样斑块病变,结果提示本实验中ApoE-/-小鼠AS模型建立已经成功;与H组比较,HE组小鼠主动脉AS病变程度明显减轻,AS病变多限于脂纹期,仅局部形成少量纤维斑块。表明14周耐力运动具有预防或减少AS形成的作用。 ②耐力训练对ApoE-/-小鼠已形成的AS的干预效果 与H组比较,HH组小鼠主动脉AS病变进一步加重,AS斑块面积与血管腔总面积比例达58.80±6.40%,且多为粥样斑块病变或出现易损斑块特征。对已形成AS的H+E组小鼠实施12周耐力运动干预后发现,其主动脉AS斑块面积占血管腔总面积比例为50.35±3.52%,与H组比较有显著性差异（P＜0.05）,但较HH组AS斑块面积显著减少（P＜0.05）,且病变程度相对减轻。表明12周耐力运动对ApoE-/-小鼠已经形成的AS具有减缓或控制其病变进程的作用。 3、耐力训练对ApoE-/-小鼠血脂水平的影响 与正常对照组比较,ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均显著升高,HDL-C显著降低,表明ApoE-/-小鼠出现典型的高胆固醇血症和血脂紊乱;而耐力性运动对ApoE-/-小鼠血脂及脂蛋白成分均未产生明显的影响。 4、耐力训练对ApoE-/-小鼠血清OX-LDL水平的影响 与正常对照组比较,ApoE-/-小鼠OX-LDL水平明显升高;与H组比较,HE组OX-LDL水平显著降低（P＜0.05）;与HH组比较,H+E组OX-LDL水平显著降低（P＜0.05）。提示ApoE-/-小鼠体内存在异常氧化状态和较高的OX-LDL水平,而耐力性运动能有效地减少OX-LDL的生成。 5、耐力训练对ApoE-/-小鼠主动脉NF-κBmRNA及其蛋白表达的影响 与正常对照组比较,ApoE-/-小鼠主动脉NF-κBmRNA及NF-κBp65均呈高度表达。与H组比较,HE组NF-κBmRNA、NF-κBp65表达强度和阳性细胞表达率均显著降低（P＜0.01）;与HH组比较,H+E组主动脉NF-κBmRNA、NF-κBp65表达强度和阳性细胞表达率均显著降低（P＜0.05）。提示ApoE-/-小鼠血管壁中NF-κBmRNA及NF-κBp65高度表达,而耐力运动可有效地抑制或降低其表达量。 6、耐力训练对ApoE-/-小鼠主动脉炎症因子表达的影响 与正常对照组比较,各组ApoE-/-小鼠主动脉炎症因子TNF-α、ICAM-1和MMP-9均呈高度表达,提示AS病变与炎症反应有密切关系;而耐力运动能有效地减少ApoE-/-小鼠主动脉相关炎症因子的表达。 7、ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块面积与NF-κBp65、OX-LDL的相关关系 相关分析表明,ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块面积与NF-κBp65、OX-LDL之间呈显著正相关。 结论: 1、14周耐力训练能有效地预防ApoE-/-小鼠AS的形成。 2、12周耐力训练对ApoE-/-小鼠已经形成的AS起到了减缓其病变进展的作用。 3、耐力训练防治AS的效果可能是通过下列机制发挥抗AS作用:耐力训练通过降低ApoE-/-小鼠OX-LDL水平和NF-κBmRNA的表达,进而下调参与AS形成的相关炎症因子ICAM-1和MMP-9的表达,降低了AS病灶中的炎症反应,从而起到抑制或减缓AS发展的作用,可能是运动防治AS的重要机制之一。