MMP-9在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用机制研究

第一部分大鼠局灶性脑缺血后MMP-9、TIMP-1、LN和FN的表达及血脑屏障通透性的改变 目的：观察基质金属蛋白酶-9(Metalloproteinase-9，MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinase-1，TIMP-1)、层粘连蛋白(laminin，LN)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)在大鼠局灶性脑缺血再灌注中的表达，及脑水肿和血脑屏障通透性改变的规律。探讨血管源性脑水肿的形成机制。 方法：将42只体重为250～350克健康雄性成年Wistar大鼠，随机分成假手术组(sham组)、脑缺血再灌注组(ischemia-reperfusion，I／R组)；采用改良的线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)2h再灌注6h、24h、48h、72h、7d模型。在预定时间点通过免疫组织化学方法研究缺血区MMP-9、TIMP-1、LN和FN的表达变化规律，干湿重法检测脑含水量，伊文思兰(Evans blue，EB)作为示踪剂检测血脑屏障通透性改变。 结果：Sham组和I／R组的非缺血区未见MMP-9的表达；而LN和FN正常表达，染色呈强阳性，血管数目较多。在I／R组，MMP-9在I／R6小时即有表达，再灌注24h明显增多，48h达高峰，72h下降，7d时有微量的表达；TIMP-1在Sham组无表达，在I／R的非缺血区也有弱阳性表达，在缺血区6h亦有表达，24h达高峰，48h时开始下降，7d时有微量表达。再灌注24h时LN和FN的表达下降，48h达高峰，7d时基本恢复正常。脑含水量的变化：再灌注6h时脑含水量即升高，再灌注24、48h时明显升高，与Sham组比较差异有显著性意义(P＜0.01)。伊文思兰在再灌注6h前就已经出现，至再灌注24-72h最为严重，各再灌注时间点与Sham组比较，有显著性差异(P＜0.01)。 结论：MMP-9和TIMP-1在缺血性脑损伤中的表达在缺血早期是增多的，随后降低；LN和FN的表达表现为由早期的较正常、降低、再回升的动态变化过程，表达规律均呈时间依耐性。MMP-9通过降解细胞外基质和基底膜中的LN和FN等，是参与BBB损伤的机制之一。 第二部分强力霉素、白黎芦醇及其联合应用对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响 目的探讨白黎芦醇、强力霉素及其联合应用的神经保护作用。 方法雄性成年Wistar大鼠174只，随机分成5组：sham组、对照组、白黎芦醇组、强力霉素组和联合用药组。分别于造模前6日每日将强力霉素(100mg／片)配制成浓度为0.75％的药液，按4ml／kg，2次／d，直接灌胃给药；白黎芦醇配制成2％的药液，按50mg／kg，腹腔注射给药，1次／日；联合用药组同时给予上述两种药物干预治疗。假手术组大鼠则同时给予上述标准等量生理盐水灌胃和／或腹腔注射。预处理6天后造模，造模成功并经评分入组后继续给予相同剂量灌胃和／或腹腔注射治疗至脑缺血2h再灌注后的6h、24h、48h、72h和7d分别处死大鼠取材，检测比较各组大鼠神经功能缺失评分、脑梗死比、脑含水量、EB含量、免疫组化MMP-9、TIMP-1、LN和FN的表达变化和电镜超微结构观察。 结果1)神经功能缺损评分：与对照组相比，药物组(分别指白黎芦醇组、强力霉素组和联合用药组，以下相同)在再灌注24、48h的评分有显著性差异；72h时联合用药组有显著性差异(P＜0.05)。2)再灌注24h时脑梗死比变化，药物组的梗死比与对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)。3)脑含水量：药物组和对照组的脑含水量在再灌注24、48和72h时比较有显著性差异。4)EB含量：药物组与对照组相比，在缺血再灌注6h、24h、48h、72h、7d各时间点的差异有显著性意义(P＜0.01，P＜0.05)。5)对MMP-9和TIMP-1表达的影响：药物组MMP-9和TIMP-1表达的部位和变化规律与对照组相似，阳性细胞数在6h、24h、48h和72h各时间点显著低于对照组(P＜0.01)。6)对LN表达的影响：与对照组相比，各药物组在再灌注的6、24、48h时间的阳性血管数的比较有统计学差异(P＜0.01)。7)对FN表达的影响：与对照组相比，各药物组在再灌注的6、24、48、72h时间点的阳性血管数的比较有统计学差异(P＜0.01，P＜0.05)。8)再灌注24h时电镜超微结构观察，与对照组相比，药物组内皮细胞的水肿程度、基底膜间隙的增大和神经元的凋亡现象相对减轻。 结论 1．白黎芦醇和强力霉素可以减轻血管源性脑水肿的形成、缩小脑梗死体积、改善神经功能的缺失，具有脑保护作用。 2．白黎芦醇和强力霉素通过抑制MMP-9的表达，从而使伴随MMP-9病理性表达升高的TIMP-1也相应减少。 3．白黎芦醇和强力霉素通过抑制MMP-9的活性而减轻LN和FN的降解，维持血脑屏障的完整性是其神经保护作用机制之一。 4．白黎芦醇和强力霉素联合应用时可以显著缩小脑梗死体积，二者在神经保护方面可能具有协同作用。