Kupffer细胞在非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用

研究目的 1. 通过高脂饮食建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝纤维化模型。 2. 观察大鼠NASH形成过程中Kupffer细胞活性的变化，以及NASH大鼠对内毒素敏感性的改变，明确NASH时Kupffer细胞功能的改变。 3. 探讨NASH大鼠Kupffer细胞功能改变的机制，包括肠道环境的变化、肠源性内毒素血症，以及游离脂肪酸、极低密度脂蛋白（VLDL）的作用等方面。 研究方法 1. 以普通饲料+2%胆固醇+10%猪油组成的高脂饲料喂养雄性SD大鼠，在实验4、8、12、16和24周分批处死。测定体重、肝脏湿重、血脂和血清转氨酶。通过HE染色和VG苦味酸染色观察肝脏肝细胞脂肪变性、炎症和纤维化程度。通过免疫组化了解肝脏Ⅲ型胶原、转化生长因子β1（TGFβ1）、α－平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。 2. 在不同实验阶段，免疫组化染色法动态观察高脂饮食模型大鼠肝脏溶菌酶和内毒素结合受体CD14抗原表达，RT-PCR法观察肝脏内毒素信号受体TLR4 mRNA细胞因子TNF-α mRNA表达，ELISA法测定血清细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。 3. 实验24周，高脂饮食模型大鼠腹腔内注射小剂量的内毒素（0.5mg/kg）后观察24小时生存率，测定血脂、血糖、血清转氨酶，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，肝组织行HE染色和VG染色观察肝脏病理。 4. 在实验不同阶段，鲎试剂偶氮显色法测定高脂饮食模型大鼠外周血和门静脉血血清内毒素水平。乳果糖组大鼠高脂饮食8周后口服乳果糖水溶液，16周处死，观察体重、肝脏湿重、血脂、血清转氨酶以及肝脏病理改变。 5. 免疫细胞化学法和放射免疫法观察软脂酸、油酸、VLDL对巨噬细胞RAW264.7核因子κB（NFκB）活性和内毒素敏感性的影响。 研究结果 1. 高脂饮食大鼠，4周出现肝细胞脂肪变性，8周表现为单纯性脂肪肝，12周24周进展为脂肪性肝炎，24周还出现肝纤维化。 第4周起高脂饮食模型大鼠肝组织CD14表达上调，溶菌酶阳性的Kupffer细胞被激活，并随着实验的进行更加明显。肝脏TLR4mRNA表达从8周开始上调，16周和24周表达最强，TNF-α mRNA在8周24周均有表达。血清TNF-α水平从 2. 8周起明显增高，IL-1β从16周起升高，IL-6水平则无明显变化。 3. 注射内毒素后24小时，24周高脂饮食模型大鼠出现急性肝功能衰竭，表现为存活率明显降低，血糖明显降低，血清ALT和AST明显升高，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高，肝组织炎症活动度计分明显升高，肝窦内还有大量血细胞淤滞。 4. 高脂饮食模型大鼠腹主动脉血血清内毒素水平在24周明显升高，门静脉内毒素水平在4周16周未见明显升高，但同期门静脉血清内毒素水平高于腹主动脉血水平。乳果糖口服明显改善高脂饮食大鼠血清转氨酶和肝组织炎症，但未减轻肝细胞脂肪变性程度。 5. 软脂酸、油酸、VLDL处理24小时可以使RAW264.7细胞核NFκB阳性率明显增加，以软脂酸最为明显；软脂酸、油酸、VLDL处理24小时还可使100μg/ml内毒素刺激后RAW264.7细胞生成的TNFα不同程度的增多。 研究结论 1. 持续24周的高脂饮食可以诱导雄性SD大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化模型。 2. Kupffer细胞活化，伴随内毒素受体TLR4和CD14表达上调，TNFα等细胞因子生成增多，是大鼠NASH形成过程中的早期事件，也是NASH大鼠对内毒素肝损伤的敏感性增强的重要原因。 3. 肝脏游离脂肪酸和VLDL增多可能是NASH大鼠的Kupffer细胞活化和内毒素敏感性增强的原因之一。 4. 大鼠NASH的早期，并不存在肠源性内毒素血症，但由于Kupffer细胞内毒素敏感性增强，肠道细菌过度生长以及肠源性内毒素仍在NASH的发病中起了一定的作用。