中国部分地区碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌耐药机制及分子流行病学研究

一、背景 铜绿假单胞菌是目前临床上常见的革兰阴性杆菌,广泛存在于自然环境中,也可存在于健康人体皮肤、呼吸道等部位。它是一种条件致病菌,易发生在免疫力受损的宿主身上。目前随着临床上广谱抗生素、激素、化疗药物等免疫抑制剂的大量使用,铜绿假单胞菌耐药现象越来越严重,出现了多重耐药及泛耐药菌株,且有不断上升趋势,给临床治疗带来了极大的挑战。碳青霉烯类抗生素是目前临床革兰阴性菌重症感染治疗的常用药物,能有效治疗产超广谱p-内酰胺酶(extended-spectrumβ-1actamases，ESBLs)和产头孢菌素酶(AmpC酶)的革兰阴性菌感染。但随之而来的碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA)菌株也不断增加,成为临床铜绿假单胞菌感染治疗中的棘手问题。 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的原因主要有：β-内酰胺酶的产生、外膜孔蛋白OprD2的缺失、主动外排系统的过度表达等,3种耐药机制单独或共同作用引起对碳青霉烯类药物的耐药。 本研究收集了我国16个城市28家医院2006年7月到2007年7月临床分离的645株铜绿假单胞菌菌株,检测其对碳青霉烯类抗生素等抗菌药物的敏感性,并对碳青霉烯类抗生素耐药菌株的分子流行病学及耐药机制进行研究。 二、材料与方法 收集2006年7月-2007年7月我国16个城市(杭州、台州、上海、南京、广州深圳、哈尔滨、沈阳、石家庄、北京、天津、西安、武汉、长沙、重庆、兰州)28家医院临床645株非重复的铜绿假单胞菌菌株。采用Kirby-Bauer纸片法和琼脂扩散法进行药敏检测；脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)及多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)进行菌株的同源性分析；Etest条检测金属酶；PCR扩增p-内酰胺酶基因(ESBLs、碳青霉烯酶及质粒介导AmpC酶等)；采用逆转录荧光实时定量PCR(Real-time RTPCR)测定碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌菌株外膜孔蛋白OprD2、外排泵MexAB-OprM以及染色体介导AmpC酶的相对表达量；PCR扩增外膜孔蛋白OprD2基因全长并序列分析；采用卡方检验对抗菌药物耐药性进行分析。 三、结果 1、药敏结果 645株铜绿假单胞菌菌株对亚胺培南及美罗培南的不敏感率分别为38.4%(248/645)及35.2%(227/645),其中258株菌株对碳青霉烯类抗生素(亚胺培南或美罗培南)耐药,占40%(258/645)。其中227株菌株为多重抗菌药物耐药菌株,占碳青霉烯类抗生素耐药菌株的88.0%(227/258)；对11种抗菌药物全部耐药菌株(泛耐药菌株)为28株,占4.3%。 2、PFGE同源性分析及多位点序列分型(MLST) 258株碳青霉烯类抗生素耐药菌株PFGE分型及同源性分析结果显示：其中246株菌株指纹图谱可分成89个型,其余12株菌株不能通过PFGE分型。根据MLST分型可分为64个ST型。其中55个ST型为新发现的ST型。 3、主要p-内酰胺酶基因分布 258株对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌菌株中,22株菌株(8个克隆)金属酶基因型阳性.占8.5%(22/258)。所有258株碳青霉烯类抗生素耐药菌株OXA-50基因均阳性。OXA-10群阳性共51株,CARB型为8株,TEM型为9株,PER型为30株,CTX-M型为9株(CTX-M-14型为3株,CTX-M-13型为1株,CTX-M-15型3株,CTX-M-3型2株),VEB型5株,SHV型5株。未检测到质粒介导的AmpC酶类DHA、ACC、LAT、CMY、MIR、ACT、MOX、FOX型及KPC、Sme、NMC、OXA-23等其他碳青霉烯酶基因型。 4、金属酶表型筛选结果 采用金属酶Etest法筛选到19株产金属酶菌株,另外3株金属酶基因阳性菌株不能被金属酶Etest法检测出,包括zy8(IMP-1),tj22(VIM-2)及ss37 (VIM-2)。 5、高产AmpC酶 258株对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌菌株中,14株碳青霉烯类抗生素耐药菌株高产AmpC酶,仅占5.4%。 6、外膜孔蛋白OprD2相对表达量及核苷酸序列 258株对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌菌株中,206株菌株存在OprD2相对表达量下降,占79.8%；158株菌株OprD2相对表达量显著降低(<0.4),占61.2%；其中19株菌株OprD2相对表达量低于0.01,占7.4%。其中5株不同克隆的碳青霉烯类抗生素耐药菌株在OprD2基因核苷酸序列的不同位点插入了插入序列ISpa1328、1SPre2类似插入序列及IS5家族的插入序列。 7、外排泵MexAB-OprM相对表达量 258株碳青霉烯类抗生素耐药菌株中,119株菌株存在外排泵MexAB-OprM显著高表达(>2.5),占46.1%(119/258)。 四、结论 1、我国铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药率高；以多克隆散发为主,部分存在院内克隆播散。 2、金属酶及高产AmpC酶并不是我国铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制。 3、外膜蛋白OprD2表达减少及外排泵MexAB-OprM高表达是我国临床分离铜绿假单胞菌菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制之一 4、首次在铜绿假单胞菌中发现了CTX-M-13、14、15、3基因型的ESBLs基因。