一、目的
研究甘草酸对中毒剂量下马钱子碱代谢动力学的影响,从上调mdrl基因诱导血脑屏障上P-gp外向转运角度研究马钱子碱中毒的解毒机制。
考察小鼠体内分别给予甘草酸及维拉帕米后,对马钱子碱单次给药动力学和脑／血浓度比值的影响；同时考察合并给甘草酸和维拉帕米后,对马钱子碱多次给药动力学和脑／血浓度比值的影响；进一步考察各组小鼠脑组织中P-gp编码基因mdr1a的表达水平,以探讨其影响机制。
二、方法
1.给药及采样
1.1选用清洁级健康成年雄性昆明种小鼠144只(30±3 g),按完全随机分组设计分为三大组,每组48只(6×8个时间点)。三大组分别连续7天腹腔注射(i.p)生理盐水(B1组)、甘草酸溶液(40 mg·kg-1)(G组)和维拉帕米溶液(5 mg·kg-1)(V组),第8天各组均腹腔注射马钱子碱溶液(30 mg·kg-1),于5、15、30、60、120、240、420和600min摘眼球取血,处死后取脑组织。血液置于肝素抗凝EP管内,离心制备血浆,脑组织用生理盐水洗净。所有样品置于-70℃冷冻待测。1.2选用清洁级健康成年雄性昆明种小鼠144只(30±3 g),按完全随机分组设计分为三大组,每组48只(6×8个时间点)。三大组分别连续7天腹腔注射(i.p)马钱子碱溶液(30 mg·kg-1)(B7组)、马钱子碱(30 mg·kg-1)加甘草酸溶液(40 mg·kg-1)(B+G组)、马钱子碱(30mg·kg-1)加维拉帕米溶液(5 mg·kg-1)(B+V组)。第7天给药后,于5、15、30、60、120、240、420和600 min摘眼球取血,处死后取脑组织。血液置于肝素抗凝EP管内,离心制备血浆,脑组织用生理盐水洗净。所有样品置-70℃冷冻待测。
1.3选用清洁级健康成年雄性昆明种小鼠15只按完全随机分组设计,每组3只,分为五组。空白对照组连续7天腹腔注射(i.p)生理盐水,Gb、Vb、B7b、B+Gb组给药方案与前G、V、B7、B+G组相同。给药后2 h小鼠放血处死,快速取出脑组织置于液氮中保存待测。
2.生物样品测定方法
2.1采用UPLC-MS/MS法测定血浆和脑组织匀浆液中马钱子碱浓度。
2.2采用实时荧光定量RT-PCR技术测定1.3项下脑组织中mdr1a基因mRNA的表达。
三、结果
1.生物样本中马钱子碱浓度的测定结果
用UPLC-MS/MS法测定血浆及脑组织匀浆液中马钱子碱浓度。血浆中,马钱子碱在5.016～5016 ng·mL-1浓度范围内线性良好。脑组织匀浆液中,马钱子碱在1.003～241.8 ng·mL-1浓度范围内线性良好。方法回收率均在91%-113%范围内,日间和日内精密度均<11.2%。
2.小鼠腹腔注射马钱子碱代谢动力学及脑／血浆药物浓度比值
2.1血浆AUC0→10h(μg·min·mL-1)：B1组为226.13±22.11,G组为255.76±32.4,V组为209.99±12.36,B7组为254.22±39.81,B+G组为355.90±32.64,B+V组为248.79±40.07。G组与B1组相比、B+G组与B7组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2脑内AUC0→10h(μg·min·mL-1)：B1组13.69±0.91,G组15.08±5.56,V组为17.89±1.24,B7组为9.43±2.32,B+G组为12.57±1.10,B+V组12.53±1.29。V、B7组与B1组比较有统计学差异(P<0.05)；B+G、B+V组与B7组相比有统计学差异(P<0.05)。
2.3脑／血浓度比值的AUC0→10h(μg·h·mL-1)：B1组1.57±0.46,G组0.98±0.13,V组为2.08±0.33,B7组为1.03±0.31,B+G组为0.48±0.32,B+V组1.50±0.66。G、V及B7组与B1组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。B+G组与B7组相比有统计学差异(P<0.05)。
3.各组大鼠脑组织中mdr1a基因mRNA表达水平
连续给予甘草酸、马钱子碱和甘草酸合用均可使小鼠脑组织中mdr1a mRNA表达增加。
四、结论
1.持续给予甘草酸不能加速小鼠血浆中马钱子碱的代谢消除,但却可加速马钱子碱在脑部的清除,说明甘草酸可能对血脑屏障上P-gp功能有一定的诱导作用,对降低中枢药物浓度有意义。P-gp抑制剂维拉帕米阻止了马钱子碱从脑部排出,由此可推断马钱子碱在小鼠体内可能是血脑屏障上P-gp底物。
2.马钱子碱具一定的自身诱导作用,对脑内浓度的影响大于血药浓度,说明其对转运蛋白的影响可能更显著。
3.通过实时荧光定量RT-PCR试验证实,连续给予甘草酸可诱导小鼠脑组织mdr1a mRNA的表达。说明甘草酸使脑部药物分布减少的主要原因为诱导P-gp,加速中枢药物的外排。本文提出的解除慢性或蓄积中毒的假设,即通过上调mdr1基因诱导BBB上P-gp的外向转运加速马钱子碱的外排,解除中枢药物中毒的研究也是可行的,对其他药(毒)物中毒的解救治疗和甘草酸新的解毒机制提供思路和理论基础。
