中药质量控制一直是中药现代化研究的难点和重点,而药效物质辨识则是支撑中药质量控制的前提和基石。然而,由于中药自身的复杂性,以及研究思路、方法和技术条件的限制,绝大多数中药的药效物质基础尚不清楚。在此背景下,现行主要以指标成分的定性定量分析为主要内容的中药质量控制模式,不可避免地陷入“难关药效,量而不准,难控难评”的窘局。
为寻求解决中药药效物质辨识与质量控制问题的新突破,本文探索建立基于成分敲出/敲入的中药药效物质辨识和质量控制新模式：以成分敲出辨识中药关键药效组分(主要药效成分和/或药效相关成分)及其相互作用关系,实现质控指标“找得准,测得准”；以成分敲入确定关键药效组分的“量-效”关系,制定科学合理的药效组分含量限度范围,实现质控指标“定得准”,为实现中药质控标准“关联药效,量而又准,可控可评”的愿景提供思路和技术参考。
本文以临床常用且药效物质相对明确的人工牛黄为模式药,抗真菌(白色念珠菌Candida albicans)作用为药效模型,初步验证该模式的科学性和可行性。主要结果与结论如下：
一、牛黄及其代用品的主要成分含量波动较大,质量差异明显
采用液相色谱法对40批牛黄及其代用品进行化学分析,发现其中6种胆汁酸类成分(牛黄胆酸钠、胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸)的含量变异较大：13批天然牛黄中6种胆汁酸总含量的变异系数为62.44%～222.56%,其中熊去氧胆酸含量的变异系数最大；20批人工牛黄中6种胆汁酸总含量的变异系数为63.27%～122.73%,其中猪去氧胆酸含量的变异系数最大。该结果提示,市售牛黄及其代用品主要化学成分含量波动较大,质量差异明显,牛黄的质量控制指标和标准尚需进一步提升和优化。
二、化学-生物指纹图谱联用可有效提高对牛黄及其代用品的鉴别效果
(1)采用液相色谱法建立了天然牛黄、人工牛黄、体内培植牛黄、体外培育牛黄和伪牛黄五类样品的化学指纹图谱,相似度分析结果显示,90%样品的相似度介于0.6～0.9之间。对化学指纹图谱进行主成分分析结果显示,所有样品被区分为四组,大部分样品能根据其品种和来源被较好的区分和鉴别,但是部分天然牛黄与体外培育牛黄、人工牛黄样品之间仍有交叉。
(2)采用微量量热法测定了40批样品作用于5种生物模型(金黄色葡萄球菌、青春双歧杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌和白色念珠菌)的生物热活性指纹图谱,结果显示白色念珠菌对样品最敏感,为优选的生物模型。对白色念珠菌的生物热活性指纹图谱进行主成分分析结果显示,所有样品被区分为五类,大部分样品能根据其品种和来源被较好的区分和鉴别,但是部分天然牛黄与人工牛黄和体外培育牛黄、人工牛黄与体内培植牛黄样品之间仍有交叉。
(3)联合化学指纹图谱和白色念珠菌的生物热活性指纹图谱,可将所有样品分为五组,其中38批样品能被有效区分和鉴别,只有2批人工牛黄与伪品交叉,不能被鉴别。该结果提示,通过化学-生物指纹图谱联用对40批牛黄及其代用品的鉴别效果明显高于分别通过化学指纹图谱和生物热活性指纹图谱对样品的鉴别效果。以上结果表明,化学-生物指纹图谱联合分析,可显著提高对牛黄及其代用品的鉴别效果,在牛黄等名贵珍稀中药材的真伪鉴定等方面具有较好的应用前景。
三、通过敲出策略,初步实现人工牛黄抗真菌关键药效物质的快速辨识
1.薄层层析法分离人工牛黄样品,得到8个目标敲出组分(记为X+)分别为：A+(牛黄胆酸钠)、B+(未知组分)、C+(混合物,组成未鉴定)、D+(熊去氧胆酸)、E+(猪去氧胆酸)、F+(胆酸)、G+(鹅去氧胆酸+去氧胆酸)和H+(混合物,组成未鉴定)。微量量热法评价8个敲出组分对白色念珠菌的抑制活性强弱顺序：H+>G+>E+>C+>F+>A+>B+>D+。未知组分的组成将在下一步工作中阐明。
2.8个敲出组分分别对白色念珠菌的抑制率之和(216.78%)是牛黄母液的(36.07%)的6倍,提示这8个敲出组分之间可能存在拮抗作用关系；进一步分析发现,这8个敲出组分与其阴性样品(已从总提物中“敲出”该组分的样品,记为X-)之间均存在拮抗作用关系,拮抗作用的强弱顺序：H+与H->E+与E->G+与G->F+与F->A+与A->C+与C->D+与D->B+与B-
3.敲出的8个组分可能为结构相似的一类成分组成的化(混)合物,与白色念珠菌相互作用时,可能竞争相同的作用靶点而发生竞争性拮抗,从而导致成分与成分、组分与组分之间产生拮抗作用关系。目前,对中药中多成分之间的拮抗关系的关注较少,本研究发现了牛黄中多成分或组分间的拮抗作用关系,提示目前人工牛黄的配方可能还需进一步优化,某些拮抗成分或许可以不加入。
四、通过敲入策略,初步制定人工牛黄抗真菌药效物质的质量控制标准：
1.通过在8个敲出组分的阴性样品中“递增敲入”各组分,并对所得样品进行抗真菌活性评价,得到8个敲出组分的“量-效”关系。
2.基于“量-效”关系,得到各敲出组分的最低含量点,定为质量控制的含量下限。初步制定的8个敲出组分的含量下限：组分A+为0.062 mg/mL、组分B+为0.274 mg/mL、组分C+为0.162 mg/mL、组分D+为0.025 mg/mL、组分E+为0.231 mg/mL、组分F+为0.343 mg/mL、组分G+为0.151 mg/mL、组分H+为0.038 mg/mL。
3.具拮抗作用的组分的含量越大,反而会降低其它组分及方药整体的活性。基于“量-效”关系得到拮抗组分的最高含量点,定为质量控制的含量上限。8个组分的含量上限：组分A+为0.062 mg/mL、组分B+为0.358 mg/mL、组分C+为0.393 mg/mL、组分D+为0.031 mg/mL、组分E+为0.362 mg/mL、组分F+为0.361 mg/mL、组分G+为0.391 mg/mL、组分H+为0.40 mg/mL。
4.对各组分的含量限度范围进行优化,得到8个敲出组分的最优含量点：组分A+为0.062 mg/mL、组分B+为0.35 mg/mL、组分C+为0.375 mg/mL、组分D+为0.025 mg/mL、组分E+为0.30 mg/mL、组分F+为0.35 mg/mL、组分G+为0.375 mg/mL、组分H+为0.35 mg/mL。按照各敲出组分的活性最优含量配比(黄金比例)组合的样品的抗真菌作用比牛黄母液提高了92.21%。该结果提示,开发“源于传统,高于传统”的“组分中药”具有一定的可行性。通过敲出/敲入策略可发现组分之间的相互作用关系和“量-效”关系,为“组分中药”的研制开发提供了新思路和方法。
综上所述,本文探索建立了基于成分敲出/敲入的牛黄药效物质辨识和质量控制模式,初步辨识了人工牛黄抗真菌的关键药效物质并制定其含量的限度范围,为阐明人工牛黄的药效物质基础提供了研究思路,也为中药的药效物质辨识和质量控制提供了实用的模式和方法。
