完全密闭发酵条件下酿酒酵母的生长代谢及其代谢通量分析

CO2是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵代谢的主要产物之一,在许多工业发酵过程,发酵基质中会积累高浓度的CO2。高浓度的CO2能降低酿酒酵母的发酵活力,阻碍其增殖,影响发酵产品的风味,导致发酵缓慢甚至中止。因此,充分认识CO2对酿酒酵母生长代谢的抑制及其作用机制具有非常重要的现实意义。但是,至今人们尚未回答,在完全密闭条件下,由于发酵产生的CO2的抑制,酿酒酵母的发酵代谢如何以及发酵何时停止这一疑问,而在抑制机制的研究上也缺乏代谢途径方面的定量研究。本研究旨在考察在完全密闭的容器内发酵葡萄汁时,发酵产生的CO2在基质中的积累对酿酒酵母生长代谢的影响,定量分析高浓度CO2对酿酒酵母代谢途径的作用。 首先,建立厌氧条件下酿酒酵母的代谢通量分析(MFA)模型,为代谢通量分析奠定基础。然后,采用常压厌氧发酵(用发酵栓隔绝空气)和完全密闭发酵(在耐压发酵罐中密封进行)这两种发酵方式,利用酿酒酵母发酵无菌葡萄汁,装液量为发酵罐容积的70%,发酵温度控制在18-20℃。考察完全密闭条件下发酵何时停止,并通过比较这两种发酵方式下酿酒酵母发酵速度、挥发性产物的种类以及酒精、甘油、乙酸和琥珀酸等的产量和产率的差别,了解CO2对酿酒酵母生长代谢的影响。最后,根据酿酒酵母在常压厌氧和完全密闭两种发酵方式下的碳源消耗速率和各种代谢产物的产率,利用已建立的代谢通量分析模型进行分析,通过比较酿酒酵母在两种发酵方式下的代谢通量图,找到CO2的作用位点。研究结果如下: 一、在完全密闭条件下,酿酒酵母每消耗5.73g L-1的葡萄糖所产生的CO2可形成1bar的压力,而当消耗糖82.0g L-1、压力达到14.3bar时,酿酒酵母的发酵代谢停止,此时发酵液的含糖量为83.0g L-1,活酵母浓度为5.5×107cfu mL-1,而常压厌氧条件(对照)下酿酒酵母几乎能够消耗完基质中的所有糖。发酵结束时,常压厌氧处理下的酵母总数约为完全密闭处理下的两倍。 二、完全密闭发酵和常压厌氧发酵两种处理下乙醇产率相差不大,但完全密闭发酵的甘油产率为常压厌氧发酵时的79.1%,而琥珀酸产率和乙酸产率分别为常压厌氧发酵时的24.7倍和26倍。 三、在已鉴定的风味物质成分中,有36种成分是常压厌氧发酵液和完全密闭发酵液共有的,有6种为完全密闭发酵液特有,2种为常压厌氧发酵液独有。与常压厌氧发酵相比,完全密闭发酵产生了更多的高级醇,3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)产量为前者的23.54倍,但酯类产量较低。 四、代谢通量分析结果表明,两种处理下酵母的代谢在乙醛产乙酸、丙酮酸产草酰乙酸、磷酸戊糖途径(PPP)和磷酸二羟丙酮产甘油等途径上的通量存在较大差异。完全密闭处理下分配给PPP途径的碳源为对照的35.6%,但流向草酰乙酸的碳源是对照的1.89倍。 通过对上述结果的讨论分析,得出如下结论:在完全密闭发酵条件下,由发酵产生并在发酵基质中积累的CO2的浓度到达一定值时能完全抑制酵母的繁殖和酒精发酵代谢;高浓度CO2能抑制酯类和甘油的合成,促进乙醇和高级醇的产生,大大提高乙酸、琥珀酸和乙偶姻的产量;代谢通量分析表明,丙酮酸产草酰乙酸途径和葡萄糖-6-磷酸产5-磷酸核酮糖途径是CO2的作用位点,而丙酮酸产乙醇途径对CO2不敏感。