增龄和预运动训练在小鼠帕金森发病中的作用：线粒体与自噬途径的分子生理学机制研究

目的：帕金森病（PD）是严重威胁中老年人群的神经变性性疾病。最近研究表明自噬在清除与神经变性疾病相关的细胞器方面起关键作用，尤其在PD的发生、发展过程中发挥重要作用，但其相关机制尚不明确。本研究以增龄小鼠为模型，通过腹腔注射MPTP建立PD模型，研究自噬的增龄性改变对MPTP毒性机制的影响，及其与线粒体功能，线粒体动力学变化之间的关系；同时选取青年小鼠进行中等强度跑台训练，6周后建立PD模型，探讨运动预训练对PD小鼠以上各项指标的影响；建立MPP+诱导的离体PC12细胞PD模型，使用药物调控自噬水平，探究自噬与PD，自噬与线粒体动力学和线粒体功能的关系。 方法： 1、90只雄性C57BL/6小鼠分为6组：4月龄对照组（4MC）、4月PD模型组（4MP）、8月龄对照组（8MC）、8月龄PD模型组（8MP）、15月龄对照组（15MC）和15月龄PD模型组（15MP），每组15只。注射MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）(30mg/kg×2次，ip，间隔16小时)制作PD模型。自然增龄组动物在相同时间以同方式接受同等剂量的生理盐水。观察各组小鼠行为学（悬挂、爬杆）变化；免疫组织化学法计数黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞数；透射电镜观察神经元超微结构改变；Oxytherm液相氧电极测定小鼠中脑和纹状体线粒体功能（态3呼吸、态4呼吸、RCR）；荧光素－荧光素酶发光法测定ATP酶合成活力；荧光分光光度计检测线粒体ROS生成速率；Western-blot法测定线粒体动力学相关蛋白（Mfn2，Fis1，Drp1）和自噬相关蛋白（Beclin1，LC3-II）表达。 2、雄性C57BL/6小鼠（6-8周），随机分为安静组和运动组。运动组进行连续6周，每周6天、每天20分钟、12米/分（75%VO2max）的跑台训练。两组再随机分成两组，于训练结束后第1天分别注射生理盐水或中等剂量MPTP造模，最后分为安静+生理盐水组（N）、运动+生理盐水组（EN）、安静+MPTP（P）、预运动训练+MPTP（EP）4组，每组15只。荧光定量PCR方法检测线粒体动力学相关蛋白（Mfn2，Fis1，Drp1）和自噬相关蛋白（Beclin1，LC3）基因表达；ELASIA法检测小鼠血清，中脑和纹状体中GDNF含量。其余检测指标同前。 3、使用250μM MPP+孵育PC12细胞48小时建立细胞PD模型，雷帕霉素和渥蔓青霉素终浓度分别为0.2μg/ml、1μg/ml，均于MPP+孵育结束前30分钟加入。实验分组为：空白对照组（C）、单独雷帕霉素处理组（CR）、单独渥蔓青霉素处理（CW）、MPP+处理组（P）、MPP++雷帕霉素处理组（PR）、MPP++渥蔓青霉素处理组（PW）。检测各组细胞存活率及丙二醛含量；透射电镜观察细胞超微结构；构建GFP-LC3质粒，转染细胞后，激光共聚焦显微镜观察自噬发生情况；利用激光共聚焦显微镜和特异性荧光染料检测各组线粒体膜通道孔开放程度（mPTP）及线粒体膜电位变化；Western-blot法检测各组自噬相关蛋白（Beclin1，LC3-II）以及线粒体动力学蛋白（OPA1，Fis1，Drp1）表达。 4、采用SPSS13.0进行统计分析。行为学测试评分各组间进行重复测量多因素方差分析。组间比较采用双因素方差分析，组内比较采用单因素方差分析。P<0.05，差异具有统计学意义。 结果： 1、增龄进程中，与4MC组小鼠相比，8MC组小鼠除体重，Fis1和LC3-II蛋白表达显著升高（P<0.01，P<0.05，P<0.05）外，其余各项指标变化无显著性；与4MC组小鼠相比，15MC组小鼠，黑质细胞数，态3呼吸，RCR，ATP酶合成活力和Mfn2蛋白表达显著下降（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.05，P<0.05），ROS生成速率，Fis1，Drp1蛋白表达显著升高（P<0.01），Beclin1，LC3-II蛋白表达显著下降（P<0.01）；三组小鼠行为学测试以及态4呼吸无显著性改变。使用MPTP造模后，与正常对照组相比，除小鼠体重和态4呼吸无显著性改变外，其余指标变化具有显著性，小鼠行为学测试评分，黑质细胞数，态3呼吸，RCR，ATP酶合成活力和Mfn2蛋白表达显著下降（P<0.01），ROS生成速率，Fis1，Drp1，Beclin1，LC3-II蛋白表达显著升高（P<0.01）；与4MP组小鼠相比，8MP小鼠变化同正常增龄过程相似，而与4MP和8MP相比15MP组小鼠各项指标显著改变（P<0.01），并且15MP组较正常对照组相比Beclin1和LC3-II蛋白上升的幅度较低。组间方差分析表明增龄和MPTP造模对小鼠爬杆测试，黑质细胞数，态3呼吸，RCR，ATP酶合成活力，ROS生成速率，Fis1，Drp1，Beclin1，LC3-II蛋白表达等指标的影响存在显著的交互作用。即伴随增龄进程小鼠对MPTP的敏感性逐渐加强，MPTP对老年小鼠的影响最为明显。 2、与N组比较，P组小鼠行为学测试评分在造模后第2天显著下降，第8天仍未恢复，且小鼠黑质细胞数显著降低（P<0.01），细胞超微结构明显异常，中脑和纹状体线粒体态3呼吸，RCR和ATP酶合成活力显著下降（P<0.01），ROS生成速率显著升高（P<0.01），Mfn2基因蛋白表达显著下降（P<0.01，P<0.05），Fis1，Drp1，Beclin1和LC3-II基因蛋白表达显著升高。与P组相比，EP组小鼠行为学测试评分在造模后第2天显著升高，第8天已恢复正常，小鼠黑质细胞数显著升高（P<0.01），细胞超微结构损伤改善，EP组小鼠线粒态3呼吸，RCR和ATP酶合成活力显著升高（P<0.01，P<0.01，P<0.05），ROS生成速率显著下降（P<0.01）Mfn2和Fis1基因和蛋白表达显著升高（P<0.01，P<0.05），Drp1基因和蛋白变化无统计学意义，Beclin1、LC3基因表达显著升高（P<0.01），Beclin1和LC3-II蛋白表达显著升高（P<0.05）。组间方差分析表明运动与MPTP造模对小鼠行为学，黑质细胞数，态3呼吸，RCR，ROS生成速率，LC3-II蛋白表达等指标的影响存在显著的交互作用。与N组相比，EP组小鼠血清中GDNF含量显著升高（P<0.01），P组和EP组小鼠脑组织中GDNF含量显著升高（P<0.01）。与P组相比，EP组小鼠血清和脑组织匀浆中GDNF含量均显著升高（P<0.01）。 3、与C组相比，P组细胞超微结构受损自噬泡增多，细胞存活率，线粒体膜电位，OPA1蛋白表达显著下降（P<0.01，P<0.01，P<0.05），MDA，mPTP开放程度，Beclin1，LC3-II，Fis1，Drp1蛋白表达显著升高（P<0.01）；与P组相比，PR组细胞自噬泡明显增多，自噬泡中线粒体数量显著增加，细胞存活率，线粒体膜电位，Beclin1，LC3-II，Drp1蛋白表达显著升高（P<0.01）， Fis1蛋白表达显著升高（P<0.05），MDA，mPTP开放程度显著下降（P<0.01，P<0.05）；与P组相比，PW组细胞超微结构损伤加剧，细胞存活率，线粒体膜电位，Beclin1，LC3-II，Fis1，Drp1蛋白表达显著下降（P<0.01），MDA，mPTP开放程度，OPA1蛋白表达显著升高（P<0.01，P<0.01，P<0.05）。激光共聚焦观察显示经MPP+处理后，细胞自噬水平提高，线粒体自噬发生增多。组间方差分析显示MPP+造模与不同药物干预对PC12细胞存活率，MDA含量，线粒体膜通道孔开放程度，线粒体膜电位，Beclin1，LC3-II，Fis1蛋白表达的影响具有显著的交互作用。 结论： 1、增龄进程中，ROS生成逐渐增多，线粒体呼吸功能降低，线粒体趋向分裂，自噬能力下降，分裂异常的线粒体不能有效清除，导致中脑黑质损伤加剧。 2、MPTP可损害小鼠中脑和纹状体线粒体功能，使自噬水平代偿性增高。伴随着增龄进程，小鼠中脑和纹状体对MPTP敏感性增强，老年小鼠对MPTP最为敏感。老年小鼠自噬代偿能力不足，在遭受同样的外界损害时，异常线粒体不能被有效清除，进而导致ROS生成增多，线粒体功能的进一步下降，神经元损伤最为严重。 3、运动使线粒体线粒体融合分裂处于高水平动态平衡，自噬水平相应增高，当MPTP损害发生时，这一过程可及时调控线粒体分裂，促进自噬水平上调，进而改善中脑和纹状体线粒体功能，减少ROS生成，发挥神经保护作用。 4、在MPP+对PC12细胞的损害过程中，细胞自噬水平的提高是细胞的自我保护机制。在此基础上上调或下调自噬水平，可相应改善或加重细胞损伤。线粒体自噬可能在此过程中发挥重要作用。