基于网络药理学研究精制清开灵注射液抗缺血性脑卒中的作用机制

脑卒中是造成死亡和残疾的主要疾病,因其高发病率、高致残率、高致死率,业已成为世界各国公共卫生领域面临的共同难题之一。清开灵注射液是临床上治疗缺血性脑卒中的中药注射液,本团队在清开灵注射液的基础上,通过组方筛选和优化,开发了由黄芩苷、栀子苷、胆酸和猪去氧胆酸四种中药活性成分构成的组分类中药精制清开灵注射液。为了在系统层次深入了解精制清开灵注射液抗缺血性脑卒中的药理机制,我们采用网络药理学和药理学实验相结的方法设计本研究。本研究首先利用网络药理学整合多种在线数据库,预测精制清开灵注射液四种成分的靶标信息,构建精制清开灵注射液成分-靶标相互作用网络,并利用Cytoscape软件自带模块分析靶标在网络中的拓扑参数、利用RichFun软件分析靶标在组织中的富集情况和利用David在线数据库分析靶标参与的生物学过程和分子功能。其次,利用在线数据库检索缺血行脑卒中治疗靶标并利用韦恩图得到精制清开灵抗缺血性脑卒中相关靶标。利用AlzData数据库分析这些靶标在脑内不同种细胞中的高表达情况,并建立精制清开灵注射液四种成分-抗缺血性脑卒中靶标-高表达细胞种类相互作用网络。利用David数据库对神经元、内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞上的高表达靶点分别进行生物学过程的富集分析,阐释精制清开灵注射液对不同种类细胞的调控作用。第三,为了在蛋白质蛋白质相互作用水平研究精制清开灵注射液抗缺血性脑卒中的潜在生物学机制,我们利用Cytoscape软件构建了分别以精制清开灵注射液靶标和抗缺血性脑卒中靶标为种子的两个蛋白质蛋白质相互作用网络,对两个进行交集融合并利用插件对该网络进行拓扑筛选,得到核心蛋白质蛋白质相互作用网络。对核心蛋白质蛋白质相互作用网络进行KEGG富集分析,并利用分子对接软件,将四种成分与信号通路上重要蛋白进行分子对接。为了验证网络药理学的部分结果,我们利用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型,并研究了精制清开灵注射液对模型大鼠神经功能评分、脑梗死体积、血脑屏障透过率、脑含水量等的影响。此外,我们还研究了精制清开灵注射液对细胞凋亡和凋亡相关蛋白、PI3K/AKT信号通路相关蛋白、炎症因子、NLRP3信号通路相关蛋白的影响。我们还利用激光共聚焦三维重建技术,研究精制清开灵注射液对星型胶质细胞和小胶质细胞体积和表面积的影响。研究结果显示,网络药理学研究得到了312个缺血性脑卒中治疗性靶标和438个精制清开灵注射液的靶标。精制清开灵注射液靶标显著富集在人脐静脉内皮细胞,血管,小脑,神经系统等组织和细胞,可能参与了缺氧的反应,炎症反应,细胞死亡的负调节和钙通道活性等生物学过程,表明精制清开灵注射液对脑血管病的潜在治疗作用。将精制清开灵注射液的靶标和缺血性脑卒中的靶标进行交集,得到47个交集靶标,分别在脑内不同细胞中有着不同的高表达情况:神经元细胞(31个),星形胶质细胞(14个),内皮细胞(13个),小胶质细胞(11个),少突触胶质细胞(11个)和少突胶质前体细胞细胞(11个)。分析这些靶标在神经元、内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中参与的生物学过程显示,精制清开灵注射液影响神经元的学习或记忆,化学突触传递,对过氧化氢的反应,对缺氧的反应,钙离子跨膜转运,凋亡过程的负调控,谷氨酸受体信号通路,白细胞-细胞粘附等生物学过程,影响内皮细胞对缺氧的反应,对VEGF刺激的反应,血管生成,增殖的正调节,参与发芽血管生成的细胞迁移的正调节,趋化因子产生,炎症反应,凋亡过程的负调控等生物学过程,影响星形胶质细胞对缺氧的反应,负调节活性氧代谢过程,血管生成的正调节,ERK1和ERK2级联的正调节,VEGFR信号通路的正调节,趋化因子产生的正调节,离子型谷氨酸受体信号通路,B细胞增殖的正调节,凋亡过程的负调节等生物学过程,影响小胶质细胞趋化因子产生的正调节,NFkB导入细胞核的正调节,细胞因子分泌的调节,I-kappa B磷酸化,一氧化氮合酶生物合成过程的正调节,细胞因子的产生,MyD88依赖性Toll样受体信号通路,炎症反应,免疫反应等生物学过程。对核心蛋白质蛋白质相互作用网络进行拓扑筛选,得到了一个包含189个节点,5754条边的蛋白质蛋白质相互作用网络。对该网络中节点进行KEGG信号通路分析发现,以P值排序,我们对排名前15个与缺血性脑卒中相关的信号通路包括PI3K/AKT、雌激素、神经营养因子、HIF-1、MAPK、Hippo、FoxO、TGF-beta、NOD样受体、凋亡、NF-kappa B、Wnt、TNF和Toll样受体信号通路。这里我们关注了PI3K/Akt信号通路和NLRP3炎症小体通路的重要分子如AKT,PI3K,PTEN,TLR4,NFΚB,NLRP3和CASPASE1,发现精制清开灵注射液四种成分与这些蛋白均有一定结合率。实验部分,精制清开灵注射液能显著减少大鼠神经功能损伤,抑制大脑梗死体积,缓解血脑屏障破坏,均有剂量依赖效应,说明精制清开灵注射液对缺血性脑卒中具有潜在的治疗作用。精制清开灵注射液还能抑制缺血性脑卒中后脑细胞的凋亡水平,提高抗凋亡蛋白BCL2和促凋亡蛋白BAX的比例,激活AKT和PI3K的磷酸化水平。精制清开灵注射液还能够显著抑制缺血性脑卒中激活的星形胶质细胞和小胶质细胞的体积和表面积,抑制星形胶质细胞和小胶质细胞标志蛋白GFAP和IBA-1的表达,促进神经元标志蛋白NeuN的表达。我们还研究了精制清开灵注射液对缺血性脑卒中炎症反应的影响,发现精制清开灵注射液能显著提高Lgals1,Timp1,Il10,Prlr,Kitlg的表达水平,并显著降低Il1b,Adipoq,Cxcl2,Ccl2,Icam1,Trem1,F11r,Gas1,Nrp1,Tnfrsf12a,Cxcl3,Flt3lg,Tnf和Il6的表达水平。这些差异表达蛋白参与TNF,细胞因子-细胞因子受体相互作用,疟疾非洲锥虫病,NOD样受体,军团病,NF-κB,Toll样受体,JakSTAT,趋化因子等信号通路。由于NLRP3是Nod样受体信号通路的重要组成部分,接下来我们研究了精制清开灵注射液对NLRP3炎症小体信号通路的影响。我们发现精制清开灵注射液能够显著下调NLRP3、CL-IL1B的水平,还具有下调CL-Caspase1和ASC蛋白水平的趋势。综上所述,本研究采用网络药理学与动物实验结合的研究模式,通过网络药理学可视化精制清开灵注射液成分、成分靶标、疾病靶标、分布细胞种类等不同层次对象之间的相互作用关系,以研究精制清开灵注射液多靶点作用特点及在生物网络中的相关重要信号通路。实验结果也表明,精制清开灵注射液具有明确的抗缺血性脑卒中药理活性,其作用机制可能体现在对多个层次的调控,包括抗凋亡、抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活、抑制炎症反应、激活PI3K/Akt信号通路和抑制NLRP3信号通路等方面。