成纤维细胞生长因子-2对成骨细胞矿化的影响及其机制研究

在骨形成过程中，成骨细胞分泌大量的生长因子如成纤维细胞生长因子-2、类胰岛素生长因子-1以及转化生长因子-β等，通过自分泌或旁分泌的方式调控成骨细胞的生长、分化和矿化。其中，成纤维细胞生长因子-2（Fibroblast growth factor-2，FGF2）在成骨以及骨枷形成中发挥重要的作用。研究表明，FGF2对成骨细胞分化和矿化的影响是分阶段性的；并且FGF2长期作用于成骨细胞可明显抑制其矿化。研究表明FGF2可通过改变PPi/Pi调控蛋白的表达抑制成骨细胞的矿化，但是FGF2影响成骨细胞矿化的机制仍不清楚，尤其是其胞外机制的研究还尚未报道。 基质小泡（Matrix Vesicles，MVs）是一类直径为30-400nm的、由膜包被的小囊泡，通过出芽的方式由具有矿化能力的细胞如成骨细胞、软骨细胞等分泌到细胞外基质中；MVs通过其富含的多种功能蛋白质在细胞外基质中吸收钙离子和磷离子,形成羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）,羟基磷灰石在MVs中继续生长，直至刺破MVs膜，定位于胶原上，启动矿化。除了在生理性矿化中的重要作用外，MVs在病理性矿化类疾病的发生和发展中也起着非常重要的作用；如MVs的功能增强是动脉粥样硬化发生的重要病理机制。尽管MVs在矿化过程中起重要作用，但是目前对MVs功能的调控机制仍知之甚少。 目的：本研究旨在探究FGF2对成骨细胞矿化的影响，并对其胞外机制进行研究。 方法：（1）采用含有抗坏血酸和β-磷酸甘油的矿化诱导液促进Saos-2细胞成骨分化及矿化，建立细胞矿化模型。（2）将Saos-2细胞分为正常对照组、矿化诱导组和FGF2组，矿化诱导组在培养液中加入50ug/ml抗坏血酸和7.5mMβ-磷酸甘油的诱导培养液50ng/ml的FGF2进行培养。三组细胞在培养第3、6、9天分别进行矿化相关基因ALP, Runx2和ColIa1的表达量检测，并进行矿化结节定性、定量检测。（3）用ExoQuickTM试剂方法提取正常对照组、矿化诱导组和FGF2组Saos-2细胞的细胞外分泌物。然后，用电子显微镜检测分泌物形态，用western blot的方法检测基质小泡表面标志物CD63和CD9的表达情况。（4）用p-NPP检测基质小泡的ALP活性，然后将提取后的MVs在矿化缓冲溶液（SCL）中孵育12h, MVs可继续吸收钙离子形成羟基磷灰石。钙离子检测试剂盒检测三组MVs孵育完之后的钙离子浓度，以检测MVs的体外矿化能力。 结果：（1）茜素红染色结果显示矿化诱导组发生明显矿化，产生大量矿化结节，对照组只有少量矿化；矿化结节定量结果显示诱导组产生的矿化结节是正常对照组的5倍左右，说明我们成功构建了Saos-2的体外矿化模型。（2）FGF2明显抑制了Saos-2细胞矿化标志标志基因ALP, Runx2和CoIa1的表达，并且减弱了细胞的矿化；证明FGF2对Saos-2细胞的成骨分化和矿化具有明显的抑制作用。（3）电镜观察发现采用ExoQuickTM试剂提取三组Saos-2细胞分泌物直径均在30-400nm之间，为膜包被小泡；Western Blot结果检测发现三组小泡均表达基质小泡标志蛋白CD63和CD9，成功提取了基质小泡。（4）ALP活性分析显示，FGF2组的ALP活性低于矿化诱导组；各组MVs孵育之后，钙离子浓度测定显示，FGF2组钙离子浓度明显低于矿化诱导组，FGF2明显抑制了基质小泡体外矿化能力。 结论：成纤维细胞生长因子-2长期作用于Saos-2细胞可明显抑制其矿化，并可通过抑制基质小泡的功能发挥其抑制作用。