溃疡性结肠炎分子标志物的筛查和发病机制的初步探讨

背景、目的 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的一个主要类型,是一种原因不明的慢性非特异性肠道炎症’。病变主要限于结肠的黏膜层和粘膜下层,以溃疡和隐窝脓肿为主要特点,多累及直肠和乙状结肠,也可遍及整个结肠2。临床表现主要是腹泻、粘液脓血便、腹痛。病情轻重不等,多呈反复发作的慢性病程。本病可以发生在任何年龄,多见于20-40岁5,亦可见于儿童或老年。男女发病率无显著差别。病理特点是粘膜的弥漫性炎症,固有膜内弥漫性淋巴细胞、浆细胞、单核细胞等炎细胞浸润,活动期有大量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润,可发生隐窝炎和隐窝脓肿。上世纪六十年代英国科学家Morson从病理学特征上将它与克罗恩病(Crohn's disease,CD)加以区分并将其界定为独立的疾病。该病在欧美国家较常见,欧洲20个中心调查显示UC的年发病率为11.2/10万,以往发病率较低的东方国家,近年也呈现增高趋势。我国1981-2000年间共计报道UC病例10218,近10年该病报道数上升3.1倍6。我国目前暂缺乏大规模的流行病学调查,但粗略估计UC发病率为11.6/10万7,而且有证据表明成逐年上升趋势8-10。而且,溃疡性结肠炎是一种癌前病变,与结肠癌的发病有关,且病程长,病变程度轻重各异,由于病因不明,临床上常常表现反复发作而治愈难度大,被世界卫生组织列为现代难治病之一。要达到UC治愈的目的,早期发现及发病机制的研究至关重要。 尽管深入到分子生物学、基因水平甚至蛋白水平的研究方法,使得溃疡性结肠炎的发病机制的研究取得了突飞猛进的发展；我们必须明确溃疡性结肠炎是多因素参与的复杂疾病,单基因或蛋白质标记物无法全面而准确地反映其复杂的发病机制。因此我们需要运用基因组、转录组和蛋白质组等高通量技术来寻找由多基因或蛋白质组成的复合型标记物,以期更准确、敏感地预测疾病,并深入阐释其发生发展的分子机制。我们都知道基因组水平的研究,主要集中在微卫星不稳定性和基因的扩增、缺失,转录组的研究重点是在mRNA水平检测基因的表达变化,可以高通量地检测组织或细胞样本中全基因的mRNA水平,建立基因表达谱,从而确定一组表达量与疾病相关的基因(Gene signature),用于疾病预测和预后评估。与基因组水平的研究相比,Gene signature更具实用性。而蛋白质组则不仅研究基因的蛋白产物丰度,还注重检测蛋白质翻译后修饰及其对蛋白功能的影响。这三个层次的研究并不孤立,都反映了差异基因的丰度和表达变化,三个层次的研究结果可以相互印证,互为补充。 前期我们首先运用双向电泳和质谱技术,比较12例溃疡性结肠炎和12例正常组织的蛋白质表达谱,从中鉴定出30种差异表达蛋白质。进一步利用生物信息学方法,找到11种与P38MAPK通路相关的差异表达蛋白质,并将这11种蛋白与该通路的关键蛋白质组成一个差异蛋白质簇。我们用Western Blot技术在上述样本中初步验证了此差异蛋白质簇与溃疡性结肠炎的相关性。然后从该蛋白质簇中选取了两种蛋白,Galectin-3和MAWBP,用免疫组化技术在56例溃疡性结肠炎和正常样本中检测其丰度。发现Galectin-3和MAWBP在溃疡性结肠炎组织中表达显著降低(χ2=31.404,P=0.000；χ2=20.541,P=0.000),并与炎症程度特异相关(χ=12.315,P=0.002；χ2=8.726,P=0.018). 本研究中,我们拟在前期试验结果的基础上,进一步探讨P38MAPK与溃疡性结肠炎的相关性和调控机制,并进一步扩大样本量研究差异蛋白簇中抽提出的蛋白质印记作为溃疡性结肠炎分子标志物的可能性。针对此蛋白印迹中的一种与溃疡性结肠炎密切相关的新蛋白MAWBP,我们对此产生了浓厚的兴趣,利用基因组学和多种分子生物学技术结合对其生物学功能及与溃疡性结肠炎的关系进行了研究。我们还进一步利用基因组学分析了溃疡性结肠炎反复迁延不愈的复杂机制,找到了重要的肿瘤相关基因,从而为溃疡性结肠炎癌前病变提供了候选标志物及有希望的新治疗靶点。 方法 1、运用Western Blot和ELISA技术,在巨噬细胞系RAW264.7中验证前期蛋白组学得到的差异蛋白簇受P38MAPK信号通路的调控,用免疫组化技术检测118例样本中差异蛋白簇磷酸化P38、Galectin-3和MAWBP的表达并分析其与溃疡性结肠炎临床特点的相关性和作为复合标志物的可能性。 2、运用Microarray和多种分子生物学方法揭示差异蛋白MAWBP在溃疡性结肠炎中的作用、功能和分子机制。首先通过免疫组化和Western Blot检测MAWBP结合蛋白MAWD在溃疡性结肠炎中的表达和定位,进而通过免疫共沉淀实验确定两者相互结合。通过构建真核表达载体转染Caco-2细胞来分别及共同高表达MAWBP和MAWD,Microarray技术分析其基因表达谱,进而通过Real-time PCR和Western Blot验证差异基因。最后通过干扰RNA技术敲低MAWBP和MAWD的表达,进一步从反方向验证MAWBP和MAWD与ERK通路的关系。 3、运用DASL技术在转录水平对溃疡性结肠炎活动期和静止期的基因表达谱进行分析,挑选同一病人同一部位的活动期和静止期内镜下标本共29例,对差异基因进行生物信息学分析,进一步通过Real-time PCR和免疫组织化学染色方法验证差异基因的表达。 4、统计学分析：我们用SPSS13.0软件来进行所有的数据分析；Pearson chi-square检验和Fisher's确切概率法来分析蛋白质表达与疾病病理特征之间的关系；方差分析及后续的基于方差分析的多重比较方法来分析Real-time PCR结果和基因组学差异基因结果；P<0.05被认为差异有统计学意义；结果的相关性我们用Pearson相关性检验,r>0.5为强相关。 结果 1、我们用Western Blot技术验证了与P38MAPK通路相关的差异蛋白质簇与溃疡性结肠炎的相关性。细胞水平进一步验证了差异蛋白簇受P38MAPK通路的调控。然后从该蛋白质簇中选取了三种可以指示P38MAPK通路活化状态的蛋白,磷酸化P38,Galectin-3和MAWBP,免疫组化结果显示这三种蛋白质与溃疡性结肠炎特异相关(χ2=41.509, P<0.001; χ2=62.668, P<0.001;χ2=68.997,P<0.001),其组成的蛋白质印记以高敏感性(94.83%)和特异性(98.33%)可以对溃疡性结肠炎进行正确判定,这种蛋白质印记是一种评估溃疡性结肠炎炎症程度的复合标志物。 2、生物信息学分析显示MAWBP为MAWD的结合蛋白,免疫组化和Western Blot结果显示MAWD同MAWBP一样也在溃疡性结肠炎组织中表达降低。免疫共沉淀实验显示了两种蛋白可以相互结合形成复合物。Real-time PCR和Western Blot结果显示MAWBP和MAWD真核表达载体成功转染入Caco-2细胞。对Microarray结果进行生物信息学分析发现MAWBP和MAWD可导致ERK1通路活化,癌基因TPX2被激活高表达,而炎症因子和趋化因子能够被抑制。Real-timePCR验证了炎症因子IL8、TSC1、CXCL2和IFIT1及癌基因TPX2的表达(P<0.05)。Microarray和Real-time PCR结果强相关(r>0.72)。Western Blot验证了MAWBP和MAWD高表达能够激活ERK通路,以及干扰RNA敲低MAWBP和MAWD的表达后能够抑制ERK通路。 3、运用DASL对溃疡性结肠炎活动期和静止期的基因表达谱进行分析,共发现上调基因909个,下调基因823个,其中上调组基因主要涉及了炎症反应、结直肠肿瘤癌基因和EMT,下调组基因主要涉及了结直肠肿瘤抑癌基因和PPAR通路。通过Real-time PCR验证了结直肠肿瘤相关癌基因MMP1、MMP3、CHI3L1和CHRDL2,抑癌基因ABCG2和PLA2G12B在UC活动期中有显著的差异表达(P<0.05),进一步通过免疫组化检测发现MMP1、CHI3L1和ABCG2在溃疡性结肠炎、结肠癌和正常组织三组之间的表达均有统计学差异(χ2=8.418, P=0.015; χ2=6.995, P=0.030;χ2=6.285,P=0.043),提示了UC的高癌变风险。结合蛋白组学及Western Blot、Real-time PCR结果发现间质标志物Vimentin在UC中升高,上皮标志物E-cadherin在UC中减低。 结论 1、运用整合蛋白组学得到一个由三种差异蛋白组成的蛋白质印记,磷酸化P38,Galectin-3和MAWBP,是一种评估溃疡性结肠炎炎症程度的复合标志物。 2、运用整合基因组学发现MAWBP及其结合蛋白MAWD可激活ERK通路、活化癌基因TPX2,并在溃疡性结肠炎中有抑制炎症的作用。 3、运用整合基因组学发现癌基因和抑癌基因在溃疡性结肠炎未发生癌变时已经发生显著变化,提示UC的高癌变风险。 4、运用整合蛋白组学和基因组学发现溃疡性结肠炎中有EMT发生。