基于蛋白组学技术研究卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮降糖作用机制

目的采用2型糖尿病大鼠模型，应用蛋白组学技术研究卷柏总黄酮的降糖作用，同时建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型，研究卷柏总黄酮及其主含成分穗花杉双黄酮改善糖尿病胰岛素抵抗的作用机制。 方法1、Wistar大鼠喂以高糖高脂饲料诱发大鼠产生胰岛素抵抗，8周后腹腔注射35mg/kg STZ建立2型糖尿病模型。以100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg浓度的卷柏总黄酮连续给药8周，脱颈椎处死动物后，提取大鼠肝脏总蛋白进行蛋白组学研究，通过PDQuest软件分别比较正常组、模型组和给药组蛋白质电泳图谱的变化，确定丰度发生三倍以上变化的差异蛋白点，经质谱分析和蛋白数据库检索，获得差异蛋白点鉴定结果，初步阐释卷柏总黄酮发挥降血糖作用的作用特点及潜在作用机制，从而为卷柏总黄酮临床前研究打下基础。同时检测大鼠血糖、血脂水平及胰岛素、胰高血糖素的分泌，初步验证卷柏总黄酮发挥降血糖作用的作用特点。采用光镜切片观察胰腺、肝脏及肾脏细胞的损伤修复状况，同时检测大鼠肝肾功能相关指标和炎症因子水平对蛋白组学结果进行验证。2、建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型，提取细胞总蛋白并进行蛋白组学研究，获得了分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。通过PDQuest软件分别比较正常组、模型组和给药组蛋白质电泳图谱的变化，确定丰度发生三倍以上变化的差异蛋白点，经质谱分析和蛋白数据库检索，获得差异蛋白点鉴定结果，同时采用Western-blot和ELISA法对蛋白组学结果加以验证，初步阐释卷柏总黄酮及其主含成分穗花杉双黄酮对胰岛素抵抗的改善作用及作用机制。 结果：1、蛋白组学结果显示，采用双向电泳技术分离得到195个蛋白点，通过软件分析得到差异蛋白点，切取具有3倍差异的30个蛋白点进行质谱检测，分析蛋白信息并归属通路后发现卷柏总黄酮发挥降血糖作用的作用机制涉及PI3K-Akt信号通路及下游的NF-κB通路、P53通路等，也均能改善糖尿病大鼠的糖代谢紊乱，调节内质网功能。大鼠脱颈椎处死后，对生化指标的检测发现卷柏总黄酮各剂量组能够明显降低大鼠FBG水平（P＜0.01），改善大鼠胰岛素抵抗状况，降低胰高血糖素（P＜0.05或P＜0.01），升高HDL水平（P＜0.05或P＜0.01），降低TG、CHOL、LDL水平（P＜0.05或P＜0.01），卷柏总黄酮能够促进胰岛素的分泌（P＜0.05）；HE染色结果显示，卷柏总黄酮可修复受损的胰岛细胞和肝细胞；为了对蛋白组学的实验结果进行验证我们检测了NF-κB信号通路下游炎症因子的表达水平，结果表明卷柏总黄酮能显著降低IL-8、TNF-α、CRP等炎症因子的水平（P＜0.05或P＜0.01）。2、为了进一步研究卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮发挥降糖作用的作用机制，采用高糖及高胰岛素的培养环境诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗，而给予卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮之后，细胞葡萄糖消耗率明显的升高，提取总蛋白进行蛋白组学研究，采用双向电泳技术分离得到148个蛋白点，通过PDQuest软件分析得到差异蛋白，切取3倍差异的20个蛋白点进行质谱分析，质谱分析结果表明卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮改善胰岛素抵抗的作用与其调节PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路，调节糖代谢，减轻肝细胞损伤等有关。在对蛋白组学结果的验证时，我们发现卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮均能上调PI3K-Akt信号通路上PI3K蛋白的表达，调节糖代谢相关蛋白的表达，下调炎症因子的表。结论：卷柏总黄酮、穗花杉双黄酮发挥降血糖作用的多靶点特征明显，其作用机制与调节PI3K-Akt信号通路、NF-κB通路有关，也与调节糖代谢紊乱有关。