山姜素对溃疡性结肠炎肠上皮屏障作用的影响

目的:炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一组肠道慢性非特异性炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD),以肠道炎症和黏膜损伤为特点。近年来,IBD的发病率显著增加,尤其是UC患者。研究表明,免疫紊乱和氧化应激反应是IBD发病的主要机制,近年研究发现,肠上皮屏障功能障碍在IBD发病中亦发挥重要作用。紧密连接(tight juction,TJ)是肠上皮屏障最重要的组成部分,其表达异常能引起肠上皮屏障通透性增加,导致肠腔内致病性抗原,如细菌、病毒、内毒素等物质进入黏膜固有层和血液循环,引发炎症和免疫反应。IBD的治疗目标是诱导并维持临床缓解及肠道黏膜愈合。研究显示,IBD患者肠黏膜TJ蛋白表达异常可发生于IBD早期阶段和复发之前,并促进疾病进展,故TJ的完整性可能对黏膜愈合发挥重要作用。TJ是由多种蛋白组成的复合体,包括跨膜蛋白、外周膜蛋白以及细胞股骨架蛋白等。其中,claudins和occludin蛋白是跨膜蛋白的主要成员,负责调控紧密连接的通透性和维持细胞极性,ZOs是外周膜蛋白家族,主要通过连接claudins、occludin以及细胞骨架蛋白,维持了TJ复合体的完整性。多项研究显示IBD患者肠黏膜TJ蛋白occludin、ZO-1表达下降,而成孔蛋白claudin-2表达升高,导致肠黏膜通透性增加。目前,IBD的治疗药物主要有抑炎药物、免疫抑制剂、生物制剂等,存在耐药、副作用多或价格昂贵的缺点,故寻找治疗新策略及新药物成为当今IBD领域的研究热点。山姜素(Alpinetin)作为中国传统中药,来源于姜科植物草豆蔻,为黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等生物活性。有研究显示,山姜素可减轻小鼠实验性急性肺损伤和结肠炎,但目前尚无山姜素对炎症性肠病肠黏膜屏障作用及机制的相关研究。本研究旨在探讨山姜素对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠上皮TJ蛋白的作用和相关机制,并探讨UC患者肠道黏膜愈合与TJ蛋白表达关系,为IBD的治疗提供新的策略及理论基础。研究方法:1.溃疡性结肠炎患者肠道黏膜愈合与紧密连接蛋白表达关系的研究。实验对象的选择:本院消化内科明确诊断为UC患者,作为观察组,收集临床资料和结肠组织标本,诊断标准按“炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012,广州)”;同期诊断为结肠息肉或结肠癌行手术切除的患者为对照组。收集手术切除后经病理学证实的正常断端结肠组织。观察组按照MCS分为4组,即临床缓解组、轻度活动期组、中度活动期组、重度活动期组。通过免疫组化和RT-PCR法检测研究对象紧密连接蛋白occludin、ZO-1、claudin-2的表达情况,并分析其与黏膜愈合指标的相关性。2.不同浓度山姜素对溃疡性结肠炎小鼠保护作用的研究。选用雄性8-10周C57BL/6小鼠42只,随机分为正常对照组、单纯山姜素组(Alpinetin 100mg/kg)、3%DSS组、低浓度山姜素组(3%DSS+Alpinetin 25mg/kg);中浓度山姜素组(3%DSS+Alpinetin50mg/kg)组;高浓度山姜素组(3%DSS+Alpinetin 100mg/kg)组,5-ASA组(3%DSS+5-ASA 200mg/kg),共7组,每组6只,山姜素采用灌胃治疗。根据各组小鼠实验期间一般情况、体重改变、DAI评分、肠管长度、组织学评分以及透射电镜观察上皮细胞紧密连接等情况,研究不同剂量山姜素对溃疡性结肠炎小鼠的治疗效果以及对肠上皮细胞间连接的作用。3.山姜素对溃疡性结肠炎小鼠肠上皮屏障保护作用的研究。通过建立不同剂量山姜素(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)灌胃治疗DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型,应用免疫组织化学、western blot及RT-PCR的方法,检测小鼠结肠黏膜紧密连接蛋白occludin、ZO-1、claudin-2的表达情况。4.山姜素对溃疡性结肠炎小鼠肠上皮屏障作用的机制研究。应用山姜素干预DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型,在给予HO-1竞争性抑制剂锌原卟啉(ZNPP)前后,通过western blot和RT-PCR法检测Nrf2/HO-1和IL-6/STAT3信号通路的变化,观察紧密连接蛋白(occludin、ZO-1、claudin-2)的变化,探讨山姜素对肠上皮屏障的作用机制。结果:1.本研究共纳入48例研究对象,对照组8例,UC患者40例。MCS和MES评分在临床缓解组、轻度活动期组、中度活动期组、重度活动期组呈上升趋势,各组间差异具有统计学意义(P<0.01)。活动期患者与对照组和临床缓解期患者相比,Geboes指数显著升高(P<0.01),缓解期患者与对照组相比,Geboes指数显著升高(P<0.05)。ZO-1、occludin的表达与MCS,MES,Geboes指数呈负相关,但Claudin-2表达与上述数比较呈正相关。免疫组化检测,与对照组相比,紧密连接蛋白(occludin和ZO-1)在观察组中的表达下降,claudin-2表达升高;在临床缓解组,ZO-1在黏膜愈合组的表达显著高于非黏膜愈合组(P<0.05)。RT-PCR检测,ZO-1的m RNA表达在黏膜愈合组显著高于非黏膜愈合组(P<0.05)。2.与对照组和单纯山姜素组相比,DSS模型组和各治疗组小鼠体重明显减轻,DAI评分、组织学评分、MPO活性显著增高(P<0.05)。与DSS模型组相比,给予山姜素以及5-ASA灌胃治疗后,小鼠体重上升,DAI、组织学评分、MPO活性不同程度降低,差异有统计学意义(P<0.05)。上述指标,100mg/kg山姜素组以及5-ASA两组比较,正常组与单纯山姜素组比较,均无显著差异(P>0.05)。透射电镜观察,对照组和单纯山姜素组结肠上皮间紧密连接呈一条致密条带,结构完整,桥粒清晰,上皮细胞表面的微绒毛排列整齐,细胞间隙狭窄,提示结肠黏膜屏障完整;DSS模型组小鼠肠上皮间紧密连接结构松散、模糊、密度降低,桥粒消失,微绒毛稀疏,短缩且长短不一,细胞间隙增宽,山姜素治疗组,紧密连接密度增加,细胞间隙缩窄,微绒毛排列整齐,出现细胞桥粒。3.应用免疫组化、Western blot和Real time-PCR法检测,与正常组相比,DSS模型组occludin、ZO-1的表达显著下降,claudin-2表达显著上调(P<0.05),山姜素治疗组较DSS模型组,occludin、ZO-1的表达上调,claudin-2蛋白表达下调(P<0.05)。与正常组相比,DSS模型组MDA含量增高,SOD活性降低,山姜素治疗组,MDA含量下降,SOD活性增高(P<0.05)。4.应用Western blot法检测,与对照组比较,DSS模型组p STAT3和IL-6表达显著上调,山姜素治疗组,表达下降,100mg/kg山姜素组效果显著(P<0.05)。Nrf2和HO-1在山姜素治疗组表达上调,100mg/kg山姜素组效果显著。应用ZNPP后,与山姜素组相比,HO-1表达显著下调,Nrf2蛋白表达无显著改变,而p STAT3和IL-6蛋白表达下调(P<0.05),紧密连接蛋白ZO-1表达显著下调(P<0.05),occludin、claudin-2表达无显著变化。结论:1.UC患者紧密连接蛋白(occludin,ZO-1)表达下调,claudin-2表达上调,ZO-1的表达水平与黏膜愈合参数有相关性,提示紧密连接蛋白也许可以作为评估UC患者治疗效果和预测黏膜愈合的指标。2.山姜素能够有效减轻溃疡性结肠炎小鼠肠道炎症及细胞间连接的破坏,疗效呈剂量依赖性。3.山姜素通过上调occludin、ZO-1和下调claudin-2表达来改善溃疡性结肠炎小鼠肠上皮屏障功能。4.山姜素可能部分通过激活Nrf2/HO-1和抑制IL-6/STAT3信号通路,调节上皮细胞紧密连接蛋白表达。山姜素调节紧密连接蛋白表达部分通过Nrf2/HO-1调控IL-6/STAT3信号通路实现。