中药材枳棋子为鼠李科枳棋属植物枳棋的干燥种子。枳棋子性平味甘,具有清热利尿、止渴除烦、解酒毒等功效,用于热病烦渴、打嗝、呕吐、二便不利、酒精中毒等症。
枳棋子中含有多种类型化学成分,主要包括黄酮、三萜皂苷、苯丙素、生物碱等。
本实验利用80%乙醇回流提取,通过柱层析、制备型高效液相色谱、结晶等分离手段从枳棋子中得到了10个单体化合物。利用核磁共振、质谱等现代波谱学手段并结合其理化性质,鉴定了这10个化合物的化学结构,它们分别为(2R,3R)-3,5,7,4',5'-五羟基-3'-甲氧基双氢黄酮、双氢杨梅素(3,5,7,3',4',5',-六羟基双氢黄酮)、(2R,3R)-3,3',5',5,7-五羟基双氢黄酮、杨梅素(3,5,7,3',4',5',-六羟基黄酮)、acerboside B、hodulosideⅢ、3-O-[(1→2)-β-D-quinovopyranosyl (1→3)-6-acetyl-β-D glucopyranosyl]-β-L-arabinopyranosyl jujubogenin hovenidulcioside A1、hovenidulcioside B1、胡萝卜苷。其中3-O-[(1→2)-β-D-quinovopyranosyl(1→3)-6-acetyl-β-D-glucopyranosyl]-β-L-arabinopyranosyl jujubogenin为首次从枳棋子中分得。
本实验还建立了枳棋子药材中(2R,3R)-3,5,7,4',5'-五羟基-3'-甲氧基双氢黄酮和(2R,3R)-3,3',5',5,7-五羟基双氢黄酮的HPLC含量测定方法。
一、枳棋子的提取、分离和结构鉴定
1.提取
将10Kg干燥的枳棋子粉碎,80%的乙醇回流提取三次,乙醇用量分别为10倍、8倍、8倍,提取时间分别为2h、1h、1h,合并,减压浓缩,得到粗提取物。
2.分离与纯化
将枳棋子的乙醇粗提取物进行硅胶柱层析,选用流动相Ⅰ进行梯度洗脱,经TLC检测,合并相同组分并减压浓缩,得到A、B、C、D、E、F、G、H、I、J十个部分。
将B部分进行硅胶柱层析,得到a、b、c三个部分,a部分通过硅胶柱层析得到化合物J-1。b、c部分经过反复ODS柱层析纯化,得到单体化合物J-3和J-4。
将C部分进行硅胶柱层析,得到d、e两部分,d部分浓缩析出絮状物,得到化合物J-5。e部分通过结晶,得到化合物单体ZJZ-A。
将D部分通过硅胶柱层析、ODS柱层析得到g部分,g部分通过制备型高效液相色谱仪分离,得到单体化合物ZJZ-E1和ZJZ-E2。
将H部分通过硅胶柱层析,得到h、i、j三部分,h、i部分经过反复ODS柱层析得到单体化合物ZJZ-a和ZJZ-b。j部分通过硅胶柱层析、ODS柱层析得到1部分,1部分通过制备型高效液相色谱仪分离,得到单体化合物ZJZ-F、ZJZ-G。
3.结构鉴定
通过'H-NMR,13C-NMR, MS等结构鉴定手段,鉴定了10个化合物,它们分别为(2R,3R)-3,5,7,4',5'-五羟基-3'-甲氧基双氢黄酮、双氢杨梅素(3,5,7,3',4',5'-六羟基双氢黄酮)、(2R,3R)-3,3',5',5,7-五羟基双氢黄酮、杨梅素(3,5,7,3',4',5'-六羟基黄酮)、acerboside B、hodulosideⅢ、3-O-[(1→2)β-D-quinovopyranosyl (1→3)-6-acetyl-|3-Dglucopyranosyl]-p-L-arabinopyranosyl jujubogenin、hovenidulcioside A1、hovenidulcioside B1、胡萝卜苷。
二、HPLC法测定枳棋子中两种黄酮的含量
1.仪器和色谱条件高效液相色谱仪：Agilent1100HPLC;检测器：VWD可变波长紫外检测器；色谱柱：Agilent HC-C8(4.6×150mm,5μm);色谱条件：流动相：甲醇-水(0.1%磷酸)16：84;流速：1.OmL/min;柱温：25℃;检测波长：290nm;进样量：20μL。
2.方法学考察
2.1线性关系
化合物(2R,3R)-3,5,7,4',5'-五羟基-3'-甲氧基双氢黄酮(J-1)和(2R,3R)-3,3',5',5,7-五羟基双氢黄酮(J-3)分别在0.025～21μg和0.375～301μg范围内存在良好的线性关系。线性方程及线性系数r分别为：J-1: y=70812x+30.094,r=0.9997J.3:y=57744x+575.17,r=0.9996
2.2检测限和定量限
由实验结果可知,化合物J-1和J-3的检测限分别为2.5ng和1.04ng;定量限分别为5.0ng和1.88ng。
2.3精密度
由实验结果可知,化合物J-1和J-3日内精密度的RSD分别为1.05%和1.01%(n=6),说明日内精密度良好。化合物J-1和J-3的日间精密度的RSD分别为0.83%和1.44%(n=6),说明日间精密度良好。2.4重复性
同一批次样品平行六次的测定结果显示,化合物J-1和J-3含量的RSD分别为1.05%和1.22%(n=6)。2.5稳定性
将供试品溶液每隔2小时注入高效液相色谱仪分析,结果表明,化合物J-1和J-3峰面积的RSD分别为1.19%、0.72%,均小于2%,说明供试品溶液在10h内稳定。
2.6加样回收率
化合物J-1和J-3的平均回收率分别为99.4%和100.1%,其RSD分别为1.55%和1.59%(n=6),均小于2%,表明J-1和J-3的回收率良好。
2.7含量测定
四个批次的枳椇子中化合物J-1的平均含量为0.029mg/g;J-3的平均含量为1.056mg/g。
3.总结
本实验深入研究了枳椇子的化学成分,并建立了枳椇子中(2R,3R)-3,5,7,4',5'-五羟基-3'-甲氧基双氢黄酮(J-1)和(2R,3R)-3,3',5',5,7-五羟基双氢黄酮(J-3)的HPLC含量测定方法,为枳椇子质量标准的完善以及枳椇子的开发利用和药理活性提供了新的科学依据。
