何首乌来源于蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根,具有解毒、消痈、润肠通便的功效。制何首乌为何首乌的炮制品,具有补肝肾,益精血,乌须发,强筋骨的功效。目前多从己知有效成分含量的变化探讨何首乌炮制前后功效改变的物质基础,但成分含量的变化并不能全面阐明何首乌炮制原理;何首乌炮制工艺缺乏规范统一的工艺技术参数、炮制对何首乌中主要有效成分含量影响的研究结果不尽相同;应用现代分析技术无法区别何首乌与制何首乌。
本文以药典炮制方法为依据,从有效成分含量变化和结构变化两个方面并结合药效学实验研究,探讨了何首乌炮制前后功效改变的物质基础,为制订何首乌科学合理的炮制工艺参数、建立区别何首乌与制何首乌的分析方法提供了科学基础。
研究中发现何首乌炮制中成分结构的变化来自于Maillard反应,进而以加热炮制的中药为研究对象,通过现代分析技术方法,确定Maillard反应普遍存在于中药加热炮制过程,但反应产物不尽相同。同时,探讨了牛膝泛糖变质的物质基础和反应途径。
在系统文献归纳总结基础上,开展了下述实验研究。
1.系统分析对比不同方法炮制后主要有效成分的含量,探讨炮制过程中各种成分的动态变化规律,为规范何首乌炮制工艺技术参数提供依据。采用HPLC法,分析了何首乌中具有保肝作用的2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯2-O-β-D-葡萄糖苷（简称:二苯乙烯苷）、抗氧化作用的游离蒽醌、泻下作用的结合蒽醌、止泻作用的鞣质和抗氧化作用的儿茶素和没食子酸在炮制前后含量的变化。不同炮制方法炮制相同时间结果显示,药典三种炮制方法中,以黑豆汁炖法有效成分二苯乙烯苷、游离蒽醌、儿茶素和没食子酸含量高于黑豆汁蒸法,然后为清蒸法;泻下作用成分三种方法无明显不同。豆汁炖不同时间各种成分含量测定结果显示,随炮制时间的延长,与制何首乌功效相一致的活性成分所占比例逐渐升高,由何首乌的77.0%到炮制32h的95.1%,之后变化不明显;泻下成分所占比例逐渐降低,由何首乌的23.0%到炮制32h的4.9%,之后变化不明显。从活性成分和泻下作用成分综合考虑,何首乌采用豆汁炖32h比较恰当。
2.采用HPLC图谱对比方法,确定何首乌炮制后除存在已知成分含量的变化,还有内在成分结构的变化。通过多批次何首乌与制何首乌HPLC图谱的对比分析,发现在相对保留时间0.298 min～0.331 min,制何首乌比何首乌多一组色谱峰,显示何首乌炮制过程中除了已知成分含量的变化,更有成分结构的改变。为了证实这组色谱峰确为炮制产生,进一步选择两个产地的何首乌药材,采用不同炮制方法炮制相同时间,以及同一方法炮制不同时间,对样品进行HPLC图谱分析,证实新的色谱峰确为炮制产生,与炮制是否用辅料、药材产地和炮制方法无关。峰面积随炮制时间的变化而变化。
3.采用化学提取分离方法得到炮制后新产生的成分,鉴定结构,并经实验证实产生途径为Maillard反应。经提取和分离条件的优选,从制何首乌中分离得到新的色谱峰代表的成分:2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4氢-吡喃-4-酮（DDMP）和5-羟甲基糠醛（5-HMF）。前者未见从中药中分离得到,其在硅胶柱、氧化铝柱和硅胶制备薄层板分离纯化时不稳定。根据DDPM和5-HMF结构特征并参考文献,推测它们为Maillard反应产物,即氨基化合物与碳水化合物（主要是糖类）在一定条件下发生的化学反应产物。为了证实推测,采用HPLC法分析了它们在炮制过程中含量的变化特点、炮制前后氨基酸含量的变化、HPLC-ELSD法测定糖类成分组成及含量随炮制时间的变化、pH值变化特点,参考炮制过程芳香气味和饮片外观颜色的变化,确认两个成分的产生途径是Maillard反应。
4.进一步采用GC-MS方法,分析鉴定了何首乌炮制后产生的其它9个Maillard反应产物。结果显示,炮制后产生的化学成分类型有呋喃类、呋喃酮类、吡喃酮类、含氮化合物和含硫化合物,它们都属于Maillard反应高级阶段的产物。除已经确定的两个成分DDMP和5-HMF,新鉴定了9个化学成分,分别为二氢-2（3H）-呋喃酮、2（5H）-呋喃酮、4-羟基二氢-2（3H）-呋喃酮、5-羟甲基二氢-2（3H）-呋喃酮、2,3-二氢噻吩、糠醛、丙酮醇、2-乙酰吡咯和4,8-二乙酰基-4H,8H-二[1,2,5]噁二唑并[3,4-b:3,4-E]吡嗪,其中5-HMF含量最高。依据峰面积随炮制时间的变化趋势将它们分为三类。
5.通过化学提取分离和波谱数据,鉴定了制何首乌乙酸乙酯部分16个化合物,5个为首次从该药材中分离得到,4个为炮制产生。通过大孔树脂、聚酰胺和C18柱层析分离技术,从中分离得到16个化合物,通过物理化学及波谱数据测定,分别鉴定为:2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4氢-吡喃-4-酮（1）,5-羟甲基糠醛（2）,3,5-二羟基-2-甲基-4氢-吡喃4-酮（3）,琥珀酸（4）,对苯二酚（5）,对羟基苯甲醛（6）,没食子酸（7）,ω-羟基大黄素（8）,ω-羟基大黄素8-甲醚（9）,2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷（10）,大黄素8-O-β-D-葡萄糖苷（11）,大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（12）,大黄素-8-甲醚（13）,2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃醌（14）,大黄素（15）,大黄素甲醚（16）,化合物1～5为首次从该植物中分离得到,化合物1～4为炮制产生。
6.探讨有效成分含量变化以及结构变化与功效变化的相关性。采用HPLC测定两种结合蒽醌大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷含量、小鼠小肠推进试验作为泻下作用的评价指标,分析了部分内在成分含量变化与功效变化的关系。两种结合蒽醌含量在炮制的前16h呈现急剧下降趋势,由16h到32h有一定程度降低,在炮制32h后呈现平稳变化;小鼠小肠推进比例在炮制16h与对照组比较有显著差异（P<0.05）,炮制32h后没有差异。显示结合蒽醌含量降低的同时,泻下作用减弱。提示何首乌在常压下炮制32h比较恰当。
以清除DPPH自由基和清除羟自由基活性为指标,对制何首乌中Maillard反应产物的抗氧化活性进行了研究,探讨内在成分结构的变化与功效变化的关系。结果显示,制何首乌中的Maillard反应产物具有清除DPPH自由基的活性,但不及二苯乙烯苷活性强。清除羟自由基能力以5-羟甲基糠醛最强,其次为制何首乌中的Maillard反应产物和二苯乙烯苷。
表明何首乌炮制前后功效的改变既与内在成分含量变化有关,又与成分结构的变化有关。何首乌与制何首乌功效的不同应该是各类成分比例变化和成分结构变化综合作用的结果。
7.建立制何首乌特异性的薄层层析（TLC）鉴别方法、指纹图谱鉴别方法和含量测定方法。经供试品的全面选取,建立了区别何首乌与制何首乌的薄层层析（TLC）鉴别方法。供试品采用乙醇提取,聚酰胺柱纯化。以5-HMF为对照品,硅胶G薄层板,石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂,15%α-萘酚乙醇溶液加热显色,日光下检视。建立的方法不仅可以区别何首乌与制何首乌,并且在一定程度上可以根据斑点颜色浓淡、斑点大小的对比,判断炮制的完善程度。
采用RRLC法,对多批次何首乌与制何首乌指纹图谱进行了对比分析。借助图谱评价软件,显示15个批次何首乌样品与生成的对照图谱相似度介于0.889～0.996,共有峰24个;14个批次制何首乌样品与生成的对照图谱相似度介于0.724～0.984,共有峰20个。炮制品的相似度低于生品,可能与炮制工艺不统一有关。生品与炮制品共有的色谱峰16个,生品有7个独有的色谱峰,制品有4个。
采用HPLC法,建立了制何首乌中5-HMF的含量测定方法。11个批次制何首乌中5-HMF含量为0.013～0.101%,4个批次何首乌中只有1个批次检出微量的5-HMF。
8.研究何首乌产地加工方法,规范制何首乌炮制工艺技术参数,对比研究现代工艺与传统工艺。以主要有效成分含量为指标,对何首乌产地净选加工方法进行了研究,认为应“除去两端”;可以“不去外皮”;将新鲜何首乌药材直接切制成制何首乌饮片的形状,既可以简化操作程序,降低成本,又可以避免水溶性成份的流失;应采用低温干燥或阴干。
依据有效成分和药理作用研究结果,对制何首乌炮制工艺技术参数进行了综合分析。认为制何首乌炮制方法应采用黑豆汁炖法,炮制时间32h。
从化学和药效学两方面对黑豆汁炖32h和传统九蒸九晒法进行了比较。测定结果表明,两种工艺游离蒽醌含量有显著差异,结合蒽醌、二苯乙烯苷、5-羟甲基糠醛和pH值没有显著差异。采用两种工艺炮制后,泻下作用明显减弱;对内毒素致大鼠脏器损伤的保护作用结果显示,动物血清CER黑豆汁炖32h优于传统九蒸九晒法;动物血清GGT传统九蒸九晒法优于黑豆汁炖32h。两种工艺作用强度方面的差异,有待进一步系统药效学考察。
9.研究中药生品与炮制品的鉴别方法,分析炮制品中存在的Maillard产物,结果显示Maillard反应普遍存在于中药加热炮制过程,为中药炮制理论提供了依据。以蒸法、炙法和炒法炮制的14味中药生品和炮制品为研究对象,通过TLC鉴别方法,以5-HMF为对照品,确定采用三种方法制备供试品溶液,可以用于区别黄芪、黄精、山茱萸、女贞子、肉苁蓉、大黄、甘草、栀子、人参、槟榔和干姜的生品与炮制品,不适用于区别黄芩和五味子的生品与炮制品。
对6味中药黄精、人参、甘草、黄芪、栀子和干姜的生品与炮制品进行了GC-MS对比分析,确定各炮制品中存在不同结构的Maillard反应产物,为中药加热炮制过程发生Maillard反应的普遍性提供了依据。
随着牛膝泛糖程度的加重,5-HMF的含量呈明显升高趋势。GC-MS分析结果表明,牛膝泛糖变质的物质基础之一应是其中糖类成分的降解产物,而不是Maillard反应。
