鱼藤酮帕金森病模型中α-突触核蛋白聚集机制研究

第一部分 实验一鱼藤酮帕金森大鼠模型的建立和行为学评价 目的:探讨鱼藤酮帕金森病大鼠模型的建立方法。方法:采用背部皮下注射鱼藤酮的方法,然后观察大鼠的行为学及黑质-纹状体的酪氨酸羟化酶免疫活性变化、海马病理学变化。结果:经过1～8周观察,鱼藤酮处理大鼠出现明显的行为学、黒质-纹状体酪氨酸羟化酶免疫活性变化,海马无明显病理学变化,表现出帕金森病的特征。结论:背部皮下注射鱼藤酮的方法可以成功制作帕金森病大鼠模型。 实验二鱼藤酮PD大鼠中蛋白聚集和细胞超微结构形态学研究 目的:探讨鱼藤酮帕金森病大鼠中α-突触核蛋白分布变化和黑质神经元超微结构改变。 方法:采用背部皮下注射鱼藤酮的方法,建立鱼藤酮PD大鼠,然后用免疫组织化学方法观察大鼠皮质、海马、黑质、纹状体等部位的α-突触核蛋白免疫活性变化;用硫堇染色观察黑质神经元尼氏体形态;用电子显微镜观察黑质多巴胺能神经元超微结构。结果:在鱼藤酮处理的大鼠中,黑质区神经元胞浆内可见α-synuclein阳性物质浓染聚集,纹状体区域基质中α-synuclein阳性染色呈团状聚集;黑质神经元胞质浓缩、尼氏体均一深染;电镜下多个细胞器受损表现,以内质网受损最为显著,或为内质网增生,或为稀疏、扩张,核糖体脱失。结论:α-synuclein蛋白在鱼藤酮处理的大鼠脑中聚集,以黑质-纹状体系统最为显著;线粒体毒素鱼藤酮可致黑质神经元中内质网损伤。 第二部分 实验一鱼藤酮致多巴胺能神经细胞早期凋亡模型的研究 目的:探讨鱼藤酮引起多巴胺能神经细胞早期凋亡的时间和浓度规律,为进一步研究其机制建立平台。方法:不同浓度鱼藤酮作用体外培养的多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞不同时间,用四唑盐比色法法检测细胞活性,用流式细胞术检测细胞的线粒体膜电位。结果:低剂量(5nmol/L和20nmol/L)鱼藤酮处理48h内对细胞活性无明显影响(P>0.05);超过100nmol/L的鱼藤酮明显抑制细胞活性(P<0.05),并且抑制的程度呈剂量依赖性。20nmol/L及更高浓度的鱼藤酮作用24h可以引起细胞线粒体膜电位明显下降(P<0.05)。结论:采用20nmol/L鱼藤酮作用24h可以建立鱼藤酮多巴胺能神经细胞早期凋亡模型。 实验二线粒体毒素鱼藤酮诱发致多巴胺能神经元内质网应激 目的:探讨早期凋亡模型中,鱼藤酮是否引起多巴胺能神经细胞内质网应激反应。方法:30nmol/L或500nmol/L鱼藤酮作用体外培养的多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞24-48h,用逆转录多聚酶链反应检测GRP78/Bip、XBP-1、caspase12基因在mRNA水平的表达。结果:小剂量鱼藤酮(30nmol/L)作用细胞24h- 48h,GRP78/Bip、XBP-1、caspase12基因在mRNA水平的表达与对照组相比明显增高(P<0.05);500nmol/L鱼藤酮作用24h, GRP78/Bip、XBP-1基因表达未见明显升高。结论:小剂量鱼藤酮诱发多巴胺能神经元内质网应激反应。 实验三鱼藤酮对多巴胺能神经细胞中α-突触核蛋白表达的影响 目的:探讨鱼藤酮对多巴胺能神经细胞中α-突触核蛋白表达的影响。方法:30nmol/L或500nmol/L鱼藤酮作用体外培养的多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞24-72h,用免疫细胞化学方法观察细胞中α-突触核蛋白的分布和形态学变化;用逆转录多聚酶链反应检测细胞α-突触核蛋白在mRNA水平的表达;用Western-Blot方法检测α-突触核蛋白量的改变。结果:500nmol/L鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24hα-突触核蛋白蛋白量显著减少(P<0.05);小剂量鱼藤酮处理细胞后24-72h,α-突触核蛋白表达随作用时间延长呈缓慢线性上升趋势,在72h表达增高最为明显,与对照组相比p<0.05;而在mRNA水平表达于48h短暂回落后继续呈上升趋势。结论:小剂量鱼藤酮可以在mRNA和蛋白水平上调α-突触核蛋白的表达。这可能是它诱发内质网应激的基础。