葛根素对成骨细胞及破骨细胞的作用及作用机制的研究

1研究目的： 本实验通过体外细胞培养,研究了葛根素对成骨细胞增殖和分化及破骨细胞形成的影响；通过对成骨细胞的多种骨分化指标基因表达的观察,以及研究葛根素对TNF-α抑制的成骨细胞的保护作用,探讨葛根素影响骨代谢的作用机制,为更深入认识葛根素在骨代谢中发挥的作用提供线索和依据。 2研究内容与方法： 2.1分离培养小鼠颅骨成骨细胞,建立体外培养的成骨细胞模型,观察成骨细胞的形态。 2.2研究葛根素对小鼠成骨细胞增殖和分化的影响在体外培养的小鼠成骨细胞中加入10-7～10-5mol/L的葛根素,培养1～7天,采用MTT四唑盐比色法测定1天,3天,5天和7天细胞增殖情况；PNPP法测定1天,3天和6天细胞碱性磷酸酶的活性。 2.3研究不同浓度TNF-α对小鼠成骨细胞增殖和分化的影响。在小鼠成骨细胞中加入Ong/mL,5ng/mL,10ng/mL,30ng/mL,50ng/mL的细胞因子TNF-α培养。采用MTT四唑盐比色法测定48h的细胞增殖,PNPP法测定72h细胞碱性磷酸酶的活性 2.4研究葛根素对TNF-α扌印制的小鼠成骨细胞增殖和分化的影响。在小鼠成骨细胞中加入5ng/mL的细胞因子TNF-α,并加入10-7～10-5mol/L的葛根素共同培养。1天,3天,5天和7天细胞增殖情况；PNPP法测定1天,3天和6天细胞碱性磷酸酶的活性。 2.5研究葛根素对成骨细胞分化指标mRNA表达的影响。在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞中加入10-6mol/L勺葛根素培养。在5天,7天,10天和12天提取细胞的总RNA,采用半定量聚合酶链式反应RT-PCR法俭测ALP、 RANKL、 OPG、 OPN、 BSP、 BGP mRNA的表达。 2.6建立体外诱导破骨细胞模型。分别采用小鼠骨髓细胞和小鼠巨噬细胞株RAW264.7,加入细胞因子M-CSF和RANKL诱导破骨细胞形成,并进行TRAP抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞形态。 2.7观察葛根素对破骨细胞形成的影响。在诱导破骨细胞形成的过程中加入10-7～10-5mol/L的葛根素,6天后进行TRAP抗酒石酸酸性磷酸酶染色,观察葛根素对破骨细胞形成数量的影响。 3研究结果： 3.1葛根素促进了小鼠成骨细胞的增殖和ALP活性,在10-7-10-5mol/L的范围内量效关系。 3.2TNF-a抑制了小鼠成骨细胞的增殖和ALP活性,在5-50ng/mL范围呈量效关系。 3.3浓度为10-7-10-5mol/L的葛根素抑制了由5ng/mL TNF-α(?)秀导的细胞数量的减少。药物作用在1-5天较明显。葛根素能够减轻TNF-a对成骨细胞ALP活性的抑制,但无统计学差异。 3.4浓度为10-6mol/L的葛根素下调了成骨细胞的RANKLmRNA的表达,上调了OPG mRNA的表达；上调ALP、 BSP、 BGP mRNA的表达：对表达有双重调节功能：上调OPN mRNA高峰期的表达,缩短其高表达的时间。 3.5葛根素抑制了破骨细胞形成。 4结论： 4.1葛根素能够促进小鼠成骨细胞的增殖,并增强其ALP活性。 4.2葛根素能有效抑制由TNF-α导致的细胞数量的减少,能够减轻TNF-α又(?)成骨细胞ALP活性的抑制。 4.3葛根素能明显下凋MC3T3-E1小鼠成骨样细胞中RANKLmRNA的表达,对OPG mRNA表达有上调作用,但不明显。显示葛根素可能通过能够提高OPG/RANKL表达比值,从、而影响骨代谢。 4.4葛根素能上调MC3T3-E1小鼠成骨样细胞中ALP、 BSP、 BGPmRNA的表达,提示葛根素可能通过促进成骨细胞分化和矿化两方面加强成骨细胞功能,从而改善骨代谢。对OPN mRNA的调控较为特殊,能缩短OPN mRNA高表达的时间,增加高峰期的表达量,提示葛根素可能对OPN mRNA表达有双重调节作用。 4.5葛根素能有效抑制破骨细胞的形成,提示葛根素能通过减少破骨细胞的数量抑制骨吸收。