酪蛋白非磷肽酶膜耦合法制备ACE抑制肽

酪蛋白磷酸肽（CPPs）是具有结合矿物质作用的活性肽,人们对它的研究开发较早,已经实现工业化生产,但是伴随其生产产生的副产物CNPPs未得到足够的重视和研究开发。由于CNPPs中的疏水性氨基酸含量较高,是ACE抑制肽的良好来源,特别是肽段相对分子质量小、含有特定疏水性氨基酸时具有较高的ACE抑制活性,因此本研究采用酶膜耦合法处理CNPPs制备ACE抑制肽,通过对CNPPs的控制水解,制备和分离相对分子质量较小的酶解产物,循环利用水解酶,建立一种制备ACE抑制肽的新方法。 首先,对CNPPs的氨基酸组成和相对分子质量分布进行测定,结果表明,CNPPs疏水性氨基酸的摩尔百分比和疏水性值分别为54.67%和7.47,相对分子质量大于1500Da的肽占相当大一部分比例。CNPPs经1K膜超滤分离后,相对分子质量小于1K Da滤过液的ACE抑制率为50.40%,远高于相对分子质量大于1K Da的肽的ACE抑制率18.82%。结合CNPPs和ACE抑制肽的组成和结构特点,有对CNPPs进一步研究的必要。 然后,对CNPPs酶膜耦合法制备ACE抑制肽水解用酶进行筛选。对几种蛋白酶制备的ACE抑制肽的抑制活性、得率和酶活力保留率的测定结果表明,Protease N制备ACE抑制肽的抑制率大于55%,酶活力保留率大于90%,优于其它几种蛋白酶。ACE抑制肽得率较高,仅次于AS1398中性蛋白酶。综合考虑,Protease N是适合酶膜耦合法制备ACE抑制肽的水解用酶。 接着研究了CNPPs酶膜耦合反应的条件。以ACE抑制肽得率和酶残余活力为指标,确定了各反应条件对CNPPs酶膜耦合反应影响的主次顺序为:压力>进料速度>温度>加酶量。最后得出CNPPs酶膜耦合反应较佳条件为:压力12psi,进料速度145mL/min,温度47.5℃,加酶量6000 U/g蛋白质。在此优化条件下对CNPPs酶膜耦合反应,达稳定状态后,滤液肽浓度为2.5mg/mL,膜通量为50mL·min-1·m-2,反应器中肽浓度为5.7 mg/mL,蛋白酶活力每小时下降8%左右。 最后对ACE抑制肽进行脱盐并对产品性质进行测定。大量无机盐的存在使ACE抑制肽的品质受到影响,本文选择DA201-C大孔吸附树脂可以完全脱除ACE抑制肽中的盐分。用85%（v/v）乙醇静态解吸,蛋白质回收率大于85%,所得ACE抑制肽脱盐率大于95%。IC50值由脱盐前0.86mg/mL降到脱盐后0.12mg/mL。经体外消化稳定性实验发现ACE抑制肽具有稳定性。