Notch信号通路在肺成纤维细胞表型转化中的作用及机制研究

目的：探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号前后，在肺成纤维细胞中Notch信号通路受体Notch1、配体Jagged1及肌成纤维细胞标志因子α-SMA表达的变化,研究Notch信号通路在肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中的作用。 方法：采用胰酶消化法，从新出生2-3天的S-D大鼠肺组织中分离培养肺成纤维细胞，波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学法鉴定培养至第三代的成纤维细胞的纯度，无血清培养基同步24h，再将细胞分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+DAPT组；TGF-β1组及TGF-β1+DAPT组加入5ng/ml的TGF-β1诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，TGF-β1+DAPT组同时加入500nmol/l的DAPT抑制Notch信号的表达；分别采用免疫细胞化学法检测α-SMA蛋白的表达变化，RT-PCR法检测Notch1、Jagged1和α-SMA mRNA的表达变化，Western-blot法检测Notch1、Jagged1和α-SMA蛋白的表达变化；采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，两样本均数的比较采用t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。 结果：（1）Vimentin免疫细胞化学：几乎100%细胞胞浆内可见棕褐色颗粒及条纹，证明胰酶消化法培养至第三代的几乎全为成纤维细胞；（2）α-SMA免疫细胞化学：未加药物干预的对照组细胞中少部分细胞内有淡黄色颗粒及条纹，TGF-β1组大部分细胞内有黄色和黄褐色颗粒及条纹，TGF-β1+DAPT组部分细胞内有淡黄色颗粒及条纹；（3）α-SMAmRNA和蛋白表达：TGF-β1组α-SMA的mRNA和蛋白的相对吸光度值（0.8510.027和0.7850.020）较对照组（0.3950.018和0.3910.022）和TGF-β1+DAPT组（0.3540.029和0.3970.016）显著升高，但对照组与TGF-β1+DAPT组比较则差异无统计学意义（P>0.05）；（4）Notch1mRNA和蛋白表达：TGF-β1组Notch1mRNA和蛋白相对吸光度值分别为0.783±0.018和0.701±0.026，较对照组（0.278±0.022和0.312±0.019）和TGF-β1+DAPT组（0.313±0.029和0.345±0.022）明显升高，而对照组和TGF-β1+DAPT组相比较则差异无统计学意义（P>0.05）；（5）Jagged1mRNA和蛋白表达：TGF-β1组Jagged1mRNA和蛋白相对吸光度值（0.851±0.028和0.847±0.026）较对照组（0.392±0.021和0.394±0.027）和TGF-β1+DAPT组（0.404±0.024和0.409±0.026）升高显著，对照组和TGF-β1+DAPT组相比较则差异无统计学意义（P>0.05） 结论：TGF-β1可以诱导肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，转化过程中Notch1、Jagged1和α-SMA mRNA及蛋白均表达升高，DAPT抑制Notch信号后，可以阻止肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，下调Notch1、Jagged1和α-SMAmRNA及蛋白的表达，进而抑制肺纤维化。