三角帆蚌多糖提取、纯化、生物活性及其结构

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii Lea)俗称河蚌、珍珠蚌等,为我国特有的淡水贝 类,具有多种应用价值。其分布范围广泛、自然资源丰富,如何科学合理地开发利用这一宝贵资源是一个值得重视的研究课题。 三角帆蚌自古以来就是药食同源动物之一。目前对三角帆蚌多糖(HCPS)的研究较少,而且不够深入。本论文对HCPS进行了较系统的研究,包括提取条件优化、分离纯化、理化性质、抗氧化活性、免疫调节活性以及结构等方面。主要结果如下： 1三角帆蚌多糖提取条件优化 运用热水浸提、乙醇沉淀、Sevag法脱蛋白、乙醇再沉淀的方法提取获得了三角帆蚌多糖,提取得率1.30-3.60%之间。 选择提取温度、提取时间、水料比及提取次数4个因素分别进行单因素实验,在单因素实验基础上,选择提取温度、提取时间及水料比3个参数进行三因素三水平的Box-Behnken实验(BBD),对此3个参数的实验组合进行优化。得出三角帆蚌多糖的最优提取条件为提取温度80℃、提取时间4.5 h、水料比8ml/g、提取次数2次。 选用5次优化的提取条件和5次随机设定的提取条件,对模型方程的适用性进行验证。结果表明实验值与模型方程的预测值间存在很好的相关一致性,说明优化出的提取条件是切实可行的。 2三角帆蚌多糖分离纯化 运用DEAE-纤维素-52和葡聚糖G-100色谱柱对HCPS粗品进行初步分离和进一步纯化,得到HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3三个组分。三个组分HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3的得率分别是26.91%、30.18%和3.93%。 采用HPLC法对HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3的纯度进行进一步鉴定,证明HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3三者都是均一的多糖组分。 3三角帆蚌多糖基本理化性质 运用化学的、物理的方法分别测量分析了三角帆蚌粗多糖及其纯化产品HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3的基本理化性质。 对于粗HCPS、HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3:总糖含量分别是76.43%、98.88%、96.60%和80.06%,蛋白质含量分别是1.36%、未检出、未检出和9.42%,糖醛酸含量分别是13.17%、16.66%、16.37%和17.25%,硫酸基含量分别是1.38%、0.38%、0.60%和6.29%,相对粘度分别是1.18、1.16、1.16和1.31。粗HCPS由6种单糖组成,鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖摩尔百分含量分别是5.71%、2.21%、1.69%、3.40%、82.21%和4.78%;HCPS-1由2种单糖组成,阿拉伯糖、葡萄糖摩尔百分含量分别是2.12%和97.88%；HCPS-2仅由1种单糖葡萄糖组成；HCPS-3由5种单糖组成,鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖摩尔百分含量分别是13.80%、4.50%、7.70%、64.92%和9.07%。HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3的相对分子质量分别是432.2、457.9和503.1 kDa。 粗HCPS、HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3含有多糖类物质的特征吸收峰、含有羧基的吸收峰、含有吡喃糖环的吸收峰。HCPS-3比粗HCPS、HCPS-1及HCPS-2含有较强的蛋白氨基吸收峰。HCPS-3比粗多糖、HCPS-1及HCPS-2含有较强的硫酸基特征吸收峰。 4三角帆蚌多糖抗氧化活性 运用化学方法分别测量分析了粗HCPS、HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3的体外抗氧化活性。结果表明：粗HCPS、HCPS-1. HCPS-2和HCPS-3在体外能够清除过氧化氢(H2O2)、清除超氧阴离子自由基(O2·)、清除DPPH自由基、螯合亚铁离子(Fe2+)、还原铁离子(Fe3+),具有一定的体外抗氧化作用。HCPS-3比粗HCPS、HCPS-1和HCPS-2具有较高的体外抗氧化活性。 运用动物模型实验研究分析了粗HCPS的体内抗氧化活性。结果表明：应用低剂量粗HCPS处理可克服D-半乳糖诱导的氧化损伤；应用高剂量粗HCPS处理可以显著地抑制肝脏和血清中脂质过氧化产物(MDA)的生成,显著地提高肝脏和血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及非酶性抗氧化能力(TAOC),且这种变化与粗HCPS呈现剂量依赖关系。粗HCPS具有一定的体内抗氧化作用。 5三角帆蚌多糖免疫调节活性 运用细胞模型实验研究比较了粗HCPS、HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3的体外免疫调节活性。结果表明：粗HCPS、HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3在体外能够显著地促进脾细胞增殖、提高腹腔巨嗜细胞酸性磷酸酶活性、增强腹腔巨嗜细胞吞噬中性红能力,具有一定的体外免疫增强作用。HCPS-3比粗HCPS、HCPS-1和HCPS-2具有较高的体外免疫增强活性。 运用动物模型实验研究分析了粗HCPS的体内免疫调节活性。结果表明：应用低剂量粗HCPS处理可以使因环磷酰胺(CPA)诱导产生的免疫功能低下得以恢复；应用高剂量粗HCPS处理可以显著地提高脾脏指数、胸腺指数、迟发型超敏反应(DTH)的耳肿胀度、血清中溶菌酶(LZM)的含量和活性,且这种变化与粗HCPS呈现剂量依赖关系。粗HCPS具有一定的体内免疫增强作用。 6三角帆蚌多糖结构 傅立叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振(NMR)技术研究表明：HCPS-1. HCPS-2和HCPS-3三个组分的糖环形式均为吡喃糖环；HCPS-1、HCPS-2的糖苷键构型均为α型,HCPS-3的糖苷键构型既有α型又有β型。 高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应、气相色谱／质谱联用(GC/MS)以及NMR技术研究表明：HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3三个组分中葡萄糖的连接方式都是以1→4糖苷键为主,存在1→4,6和1→3,4分支以及一些末端糖基(1→)；HCPS-1中的阿拉伯糖和HCPS-3中的鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、半乳糖绝大部分或全部都是以1→3糖苷键为主,穿插在葡萄糖主链和支链中。 刚果红实验研究表明HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3三个组分均不具有三股螺旋结构。稀碱水解反应研究表明HCPS-3上肽链与糖链的连接键型为O-型糖肽键。酸水解-柱前衍生化-HPLC法测量分析表明：HCPS-3中共检测出13种氨基酸,它们分别是天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸,其中甘氨酸含量最高,占总氨基酸质量百分比为25.18%,苯丙氨酸含量最低仅为3.13%。