虾蟹混养池细菌多样性的研究

本论文针对当前海水养殖环境微生物作用研究的热点问题,首次将PCR-DGGE技术引入到我国虾蟹混养池微生物生态学的研究领域,优化了虾蟹混养池沉积物的总DNA提取方法及DGGE分离方法,并结合传统的平板培养方法对泉州湾滩涂虾蟹混养池的沉积物及水体的理化因子、细菌数量及细菌多样性随养殖时间推移的动态变化及空间上的变化进行了研究,同时对沉积物细菌总DNA的DGGE图谱的16Sr DNA片段的主要亮带进行克隆、测序。研究取得以下主要结果: 1.沉积物总DNA提取的方法:先以TENP缓冲液去除沉积物中的腐殖酸,继之以溶菌酶-SDS温和裂解,其提取效率达90%以上,所获DNA产量达2-20μg/g湿重沉积物,片段大小均在23 kb左右,不经纯化即可直接进行PCR扩增和限制性酶切等分子生物学操作。 2. DGGE分离方法:采用对大多细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对GC-341F和517R,以普通Taq酶进行PCR扩增,将长约200bp的扩增产物使用变性剂浓度梯度为40﹪到60﹪的8﹪的聚丙烯酰胺凝胶进行分离,最后对电泳谱图进行分析,得出其中细菌多样性的信息。 3.检测池在整个养殖期,理化因子都在对虾养殖耐受范围内,呈波动状态,不存在明显的规律;沉积物中的总菌数(DAPI计数)随着养殖时间的推移呈波动状态、总体呈上升趋势,与总有机碳呈明显的相关性;水体及沉积物中的异养菌数、弧菌总数都呈波动状态、总体呈下降趋势,与水温、溶解氧、总氮、磷酸盐等环境因子相关性不明显。 4.新旧池水体及沉积环境都存在丰富的细菌多样性,但相对而言,放苗前和养成前期均较低,从养成中期开始逐渐升高,养成末期又有所下降;其细菌群落结构在整个养殖期处于动荡变化状态;沉积物细菌多样性较水体的丰富且稳定性较好;DGGE法研究虾池的群落结构变化与可培养异养菌数的变化之间没有明显的相关性。 5.对沉积物DGGE图谱上的特征条带进行回收测序,测序结果为:γ-变形杆菌亚群、δ-变形菌亚群、拟杆菌群、厚壁菌群、放线菌群、绿弯菌群和一些未知菌群,这些菌群可能在养殖过程的物质和能量疏通方面起了重要的作用。 6.对虾蟹混养池和水源区进行异养菌数及细菌多样性的评价,结果表明,水源区的水体及沉积物异养总菌数都是高于新旧虾蟹养殖池;新池的水体及沉积物的细菌多样性都是高于水源区、高于旧池。这种差异可能与代谢调控有关系。