玉米大斑病菌黑色素合成途径相关基因的克隆及功能分析

DHN黑色素在子囊菌和半知菌中广泛存在,具有保护微生物免受紫外线和溶菌酶的作用,也是某些植物和动物病原真菌的致病相关因子。研究表明,沉积在病菌附着胞壁上的黑色素,保证了病菌能够产生足够的膨压穿透寄主组织致病。本文利用候选基因法克隆了4个玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）黑色素合成途径相关基因,其中包括1个还原酶基因（St3HNR）,2个漆酶基因（StLAC1和StLAC2）和1个调节基因（StMR）,它们分别与已知丝状真菌的相应基因具有较高的相似性。试验利用同源重组的方法获得玉米大斑病菌St3HNR和StLAC1基因敲除突变体,通过RNAi技术获得StMR基因沉默转化子,在此基础上,对目的基因进行功能研究,主要研究结果如下: 1.利用候选基因法克隆了玉米大斑病菌的1个1,3,8-三羟基萘还原酶基因,2个漆酶基因和1个调节基因,分别命名为St3HNR、StLAC1、StLAC2和StMR。获得了St3HNR、StLAC1和StMR基因的全长cDNA和DNA序列,StLAC2基因的部分DNA序列。将St3HNR基因全序列及蛋白序列提交GenBank,获得基因登录号为No. EU681832,蛋白登录号为No. ACD47140。 2.对St3HNR、StLAC1和StMR基因结构进行了分析。St3HNR基因DNA全长918 bp,cDNA为804 bp,编码267个氨基酸,分子量约为28.28 kD,有3个外显子和2个内含子;StLAC1基因DNA全长1855 bp,cDNA为1806 bp,编码601个氨基酸,含有2个外显子,1个内含子;StMR基因DNA全长3276 bp,cDNA为3036 bp,编码1011个氨基酸,含有4个外显子,3个内含子。试验中获得的所有基因的内含子均符合GT-AG法则。 3.对玉米大斑病菌St3HNR基因的相似性进行分析,结果表明,St3HNR基因编码产物与多种植物病原真菌的1,3,8-三羟基萘还原酶氨基酸序列具有95%以上的相似性,具有保守的还原酶结构域,但与玉米大斑病菌的1,3,6,8-四羟基萘还原酶（St4hnr）的相似性仅为45.9%,说明两个基因属于不同的还原酶类群,在黑色素合成途径中催化不同反应。StLAC1基因编码的氨基酸序列与多数真菌漆酶具有60%以上的相似性,StLAC2与Hortaea acidophila、Fusarium proliferatum、Gaeumannomyces graminis等真菌漆酶基因具有33%46%的相似性,但StLAC1和StLAC2间相似性仅为26.34%;StLAC1编码的蛋白具有漆酶特有的3个Cu2+活性位点,即Cu-oxidise superfamily,并且活性区域高度保守。StMR基因编码的蛋白与水稻胡麻斑病菌（Bipolaris oryzae）、玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）中调控黑色素合成的转录因子相似性为88%,该转录因子在N末端具有2个ZnFC2H2结构和一个类似Zn（II）2Cys6的GAL4 DNA结合域,与水稻稻瘟病菌Pig1p、瓜类炭疽病菌Cmr1p等转录因子结构相同,且相应区域高度保守。 4. Southern杂交结果表明,玉米大斑病菌的St3HNR和StLAC1基因在基因组中均以单拷贝形式存在,StLAC2基因以多拷贝形式存在。 5.利用真核表达载体pPIC9K构建了玉米大斑病菌St3HNR基因表达载体pPIC9K-St3HNR,采用电击转化法将重组质粒转入表达宿主菌GS115中并进行了诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明St3hnr蛋白在宿主菌中有分泌表达。 6.利用质粒pUCATPH和pBS,根据基因同源重组原理,构建了St3HNR基因敲除载体。将重组DNA片段通过PEG介导转化玉米大斑病菌原生质体,经潮霉素筛选获得了潮霉素抗性转化子,通过潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物及St3HNR基因特异性引物对转化子进行PCR筛选,得到了6个St3HNR基因缺失转化子;以潮霉素基因和玉米大斑病菌St3HNR基因为探针分别进行Southern blot验证,最终确定6个转化子均为突变体,命名为△3hnr1、△3hnr2、△3hnr3、△3hnr4、△3hnr5和△3hnr6。对突变菌株进行表型分析,结果显示6株突变体菌落均成棕红色,菌丝、分生孢子透明,菌丝和菌落形态无明显变化,但生长速度略小于野生型菌株;突变菌株产孢能力、HT-毒素产生能力、分生孢子萌发和附着胞形成能力均无明显变化;但是突变菌株附着胞膨压、附着胞穿透能力、健康寄主上的致病力显著下降或丧失,突变菌株在创伤寄主上的侵染能力没有显著变化,但是病斑扩展面积较小。 7.以ABTS为底物,采用分光光度计在420 nm下测定漆酶活力,确定玉米大斑病菌细胞内漆酶活力的影响因素。结果表明,酶活测定最佳反应条件为0.6 mmol/L ABTS底物和pH2.6的缓冲液,在反应开始后5 min进行测定;试验还发现,在250μmol/L Cu2+浓度下培养的玉米大斑病菌漆酶活性最强。 8.利用相同的基因敲除载体构建策略构建了StLAC1基因敲除载体,潮霉素和PCR筛选后获得转化子StLAC1-M2、StLAC1-M3、StLAC1-M4。转化子与野生型菌落颜色没有明显差别,但是检测到StLAC1-M3和StLAC1-M4的胞外漆酶活性降低。 9.利用PCR技术分两步扩增StMR基因片段,构建了RNAi基因沉默载体,通过潮霉素筛选得到了不同沉默表型的转化子。获得的6个转化子与野生型菌株相比,菌落颜色均发生了明显变化,由灰黑色变成了黄白色,但是不同转化子的颜色有差异。转化子R5、R7、R9和R8气生菌丝低矮,菌丝密度高,菌落边缘整齐。所有突变菌株均不产生分生孢子,菌丝透明,无黑色素沉积,菌丝形态不规整,多数弯曲并纠结在一起。 由此得出结论:1)St3HNR基因在玉米大斑病菌黑色素合成、附着胞穿透力和致病力等方面具有重要功能;2)玉米大斑病菌中存在漆酶和至少2个漆酶的编码基因,但StLAC1基因与玉米大斑病菌黑色素合成关系不明显;3)StMR基因可以影响黑色素的合成,但具体调节方式还需进一步验证。以上基因功能的研究方法为黑色素合成途径中其它功能基因的研究提供了思路。