白花蛇舌草中Src蛋白激酶抑制成分的分离鉴定

蛋白酪氨酸激酶能催化ATP上的磷酸基团转移到其它重要蛋白质的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。在细胞内参与信号传导，与细胞生长、分化、死亡等一系列生理生化过程密切相关。有资料表明蛋白酪氨酸激酶的异常与肿瘤相关。如本文使用的靶蛋白v-Src蛋白具有极强的转化效应，并能诱导细胞迁移；c-Src蛋白时空上表达的紊乱及引起的信号转导异常被认为是结肠癌、乳腺癌、成纤维细胞瘤等发生、发展的原因之一。目前，以蛋白酪氨酸激酶为靶点的药物研发是抗肿瘤药物研究的一个热点方向。已有十多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和抗体进入Ⅰ-Ⅲ期临床试验阶段，个别的已经上市，如以Bcr-Abl／PDGFR为靶点的Gleevec（STI571）、以EGFR为靶点的Iressa（ZD1839）和Erlotinib（OSI-774）。 本文在体外以Src蛋白为靶位点，从抗癌中草药白花蛇舌草（Hedvotidis Diffusae）中筛选得到两种具有蛋白酪氨酸激酶抑制活性的蒽醌类化合物。首先，利用本实验室已经构建成功的含v-Src目的基因片断的工程菌株E．coli．BL21（DE3）pGEX-KT／v-src，经菌株鉴定、表达条件优化等工作，用IPTG诱导大量表达GST-v-Src蛋白，收集包涵体蛋白，并经变性复性处理，获得具有酪氨酸激酶活性的融合蛋白。其次，建立以生物素化的聚Glu∶Tyr（4∶1）为激酶反应底物、利用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体（HRP-PY20）检测磷酸酪氨酸残基的酶联免疫吸附反应（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），以Src蛋白为筛选靶位点的蛋白酪氨酸激酶抑制剂体外快速筛选模型。再者，用硅胶柱层析、硅胶薄层层析等方法，分离纯化中草药白花蛇舌草，并从中筛选得到两种具有明显Src蛋白酪氨酸激酶抑制活性的成分。质谱（MS）、红外光谱（IR）、紫外光谱（UV）、核磁共振(1H NMR、13C NMR、HMQC)等检测鉴定结果表明，两化合物分别为2-甲基-3-羟基蒽醌（2-methyl-3-hydroxyanthraquinone）、2-甲氧基-3-羟基蒽醌（2-methoxy-3-hydroxyanthraquinone）。细胞毒性实验表明，两化合物对肝癌细胞HepG2、肺腺癌细胞SPC-A-1、乳腺癌细胞Bcap37具有明显生长抑制作用。