牛肠道病毒的分离鉴定及HLJ-3531株感染性分子克隆的建立

牛肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属成员,为单股正链RNA病毒。病毒粒子无囊膜,为二十面体球形结构,粒子直径约为25～30nm,基因组长度约为7500bp。2011年第9次国际病毒分类委员会分类报告将牛肠道病毒分类为EV-E和EV-F,其中EV-E分为EV-E1E4,EV-F分为EV-F1F6。牛肠道病毒的首次发现是在上世纪50年代末,由Kunin和Mc Ferran分别从健康牛粪便中分离得到,随后世界各地陆续有该病毒的分离报道,但中国关于此病毒的流行报道较少。牛肠道病毒的病原性并不明显,但由于其有时会侵犯其他器官而导致临床上各种综合征的出现。牛肠道病毒的感染宿主较广,包括牛、羊、马、犬、羊驼等动物。本研究从奶牛场采集两批粪便样本,第一批样本采自诊断为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）阳性的患病奶牛,第二批样本采自患有消化道疾病症状的奶牛,同时从该牛场采集获得9份牛血清,血清经BVDV抗原及抗体检测均为阴性。两批病料共先后分离得到10株病毒,经BVDV巢式RT-PCR检测均为阴性。因此,本研究对分离病毒按未知病毒进行鉴定,核酸型鉴定为RNA病毒;蚀斑纯化后电镜观察病毒粒子形态为无囊膜球形,直径约25～30nm,符合小RNA病毒形态学特征;理化特性鉴定结果表明分离病毒具有耐酸、抗有机溶剂、对热敏感等特性;RT-PCR鉴定结果表明,两批病料分离毒株分别属于牛肠道病毒EV-E与EV-F,且同一批分离毒株同源性均在99%以上。故选取两批中最早出现病变的分离病毒继续后续试验并分别命名为HLJ-3531与HLJ-4149。血清中和试验研究表明,采自同一牛场的牛血清中2份含有HLJ-3531中和抗体,5份含有HLJ-4149中和抗体,免疫电镜试验进一步揭示了抗原抗体反应复合物的存在。病毒细胞嗜性分析显示,两株病毒均可感染牛、猪、兔、非洲绿猴、鸡、犬、仓鼠、猫等多种动物细胞,但对牛、仓鼠、非洲绿猴的细胞嗜性较强,对兔、犬、猪源的细胞嗜性较弱。重组牛IFNa/β/λ等对两株病毒的繁殖均有抑制作用。为分析两株病毒的基因序列及进化树关系,参考NCBI已公布序列,设计简并引物,采用重叠RT-PCR技术扩增HLJ-3531及HLJ-4149基因组。为确保基因序列的真实性及精确性,两株病毒的5’UTR均采用RACE法扩增,其余片段则采用高保真酶扩增。经序列拼接得到,HLJ-3531病毒株全基因序列为7448bp,HLJ-4149病毒株全基因序列为7437bp,均由5’UTR、开放阅读框（ORF）、3’UTR及ploy（A）尾巴组成。两株病毒全基因组核苷酸同源性为68.40%,ORF氨基酸同源性为73.40%。以VP1序列绘制进化树,分析显示HLJ-3531属EV-E2分支,与56/59/1株核苷酸同源性最高（77.71%）,与SD1182 II株氨基酸同源性最高（95.65%）;HLJ-4149属EV-F1分支,与IL/alpaca核苷酸同源性最高（81%）,与BEV-261氨基酸同源性最高（96%）。本研究以分离得到的两株病毒为研究对象建立了ICR乳鼠感染模型。两株病毒经BHK-21细胞连续传代3次后,取50μL病毒液（滴度为108TCID50/0.1m L）分别经腹腔注射感染乳鼠,在感染后4、7、14、21d取感染小鼠心、肝、肠、肺组织,进行半定量RT-PCR及HE染色检测,同时在感染后7、14、21d取感染小鼠血清分析小鼠体内抗体水平。结果表明,肉眼观察时,HLJ-3531株感染小鼠在21d可观察到肠黏膜出血症状,而HLJ-4149株感染小鼠在整个观察周期都未引起肉眼可观的病理变化;RT-PCR检测结果显示,两株病毒均不能感染心组织,可感染肝、肠、肺组织,HLJ-3531株感染小鼠整个检测周期中在肝、肠、肺中均能扩增到病毒特异性目的条带,而HLJ-4149株在感染后4、7、14d在肝、肠、肺中可检测到特异性条带,但病毒含量逐渐变少,21d已检测不到;HE染色结果显示,乳鼠在分别感染两株病毒后心组织都未出现病变,HLJ-3531株感染组小鼠在整个观察周期中肠、肝、肺组织都出现明显病变,且随感染时间的推移病变逐渐加剧,HLJ-4149株感染组小鼠肠、肝、肺组织出现病变,但其病理变化先随着时间的推移加剧（0→4→7d）,之后又开始慢慢恢复（7→14→21d）;血清中和试验显示,两株病毒感染组小鼠在第7d均已产生抗体,之后逐渐升高（14d）,HLJ-4149株感染组小鼠21d血清中抗体水平下降,而HLJ-3531组小鼠血清中依然存在较高滴度的中和抗体。致病性实验结果显示,两株病毒均可感染小鼠且引起组织病理变化,但引起病变的程度及持续时间存在差异。由于两株病毒分离自同一牛场,血清中和试验检测到同一牛血清中含有两种病毒的中和抗体,故怀疑牛场存在多重感染的现象。为验证两株病毒是否可以混合感染同一个体动物且引起病理变化,本研究以ICR乳鼠为动物模型模拟了多重感染。取等体积混合的病毒液50μL腹腔注射感染乳鼠,乳鼠在整个周期外观上与对照组相比都无明显差异,组织解剖时在14d与21d可观察到小鼠有肠黏膜出血的症状,且症状逐渐加强,21d时亦观察到肝脏肿大症状。组织RT-PCR与HE染色分析结果显示,两株病毒可同时感染同一个体且引起组织病理变化,所引起的病理变化强于单独感染组,病程亦比单独感染组较长,表明HLJ-3531株与HLJ-4149株在病毒感染过程中有协同效应。血清中抗体水平分析显示,同一个体中同时存在两株病毒的抗体,且随着感染时间的推移逐渐升高。本研究在国内外首次成功建立了牛肠道病毒乳鼠感染模型,初步研究了牛肠道病毒的致病性,为牛肠道病毒致病机制的深入研究提供了动物模型及物质基础。根据HLJ-3531全基因克隆序列拼接结果,设计全长c DNA构建引物,以pBluescript SK（-）为克隆载体,采取融合PCR与经典酶切法相结合的策略进行全长构建。HLJ-3531全基因序列分为两大片段3531-A与3531-B,在全序列5’端引入T7启动子序列。3531-A片段分为三个小片段,融合PCR获得。3531-B分为两个小片段,并在两片段重叠部分通过引物引入分子标记Nae I酶切位点（氨基酸同义突变）。含全长c DNA的重组质粒p BSK-3531鉴定正确后,线性化并转染能稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR细胞系,产生病变后连续传代。RT-PCR、分子标记测序、间接免疫荧光、免疫电镜等鉴定结果显示重组病毒r HLJ-3531拯救成功,r HLJ-3531与亲本毒株具有相似的宿主嗜性、TCID50及生长曲线。本研究成功构建了牛肠道病毒HLJ-3531株的感染性克隆,并拯救出带有分子标记的重组病毒,为牛肠道病毒基因组的结构与功能、分子致病机制的研究及载体疫苗的构建等奠定了物质基础与技术平台。