黄连素对脑缺血再灌注小鼠损伤和免疫系统的影响

目的 研究脑缺血再灌注小鼠外周和中枢免疫系统的变化,及黄连素（Bererine,Ber）对脑缺血再灌注小鼠外周和中枢免疫系统的保护作用并初步探讨其相关机制。 方法 1.线栓法建立Balb/c小鼠脑缺血再灌注模型,以缺血1 h、再灌注24 h为研究对象;通过神经功能学评分、TTC染色和HE染色来判断模型的成功与否;通过神经功能学评分的降低和脑梗死比例的减少来确定Ber的体内用药浓度,缺血0.5 h,灌注后12 h各腹腔注射一次药;共分为四个实验组:正常组（Normal）,伪手术组（Sham）,模型组（MCAO/R）;给药组（M+Ber）。在此基础上,取各组小鼠的淋巴细胞/脾细胞/胸腺细胞/骨髓细胞体外培养,加不同的刺激剂或诱导剂,研究其相关指标的变化。 2.对外周免疫系统的研究主要集中在:以流式细胞术检测淋巴结来源的淋巴细胞的活化（早期-CD69、中期CD-25、晚期CD-71）水平;通过MTT比色法和CFDA-SE染色结合流式细胞术检测Ber对刀豆蛋白A（concanavalin A,Con A）刺激的小鼠淋巴细胞增殖的影响;PI染色分析Ber对ConA刺激的淋巴细胞周期的分布情况;钙黄绿素（Calcein）和DIOC6（3）染色分析放线菌酮（Cycloheximide from microbial,CHX）诱导的淋巴细胞凋亡;H2DCFDA染色检测外周血反应性氧族（reactive oxygen species,ROS）的变化;NO测定试剂盒和H2O2测定试剂盒检测小鼠血清中NO、H2O2水平。 3.对中枢免疫系统的研究主要集中在:胸腺的萎缩情况和利用流式细胞术检测地塞米松（dexamethasone,DEX）诱导的胸腺细胞的凋亡（Calcein）;NO测定试剂盒检测cAMP诱导或未诱导情况下,同时（LPS+IFN-γ）或（LPS+IFN-γ+ATP）刺激的骨髓细胞NO的变化;NO荧光探针（DAF-FM DA）测定（LPS+IFN-γ）刺激的骨髓细胞NO分泌水平。 结果 1.通过神经学评分的降低和脑梗死面积的减少确定Ber的体内用药浓度为5 mg/kg。 2.体外实验结果表明,随着药物浓度的增加,Ber对Con A刺激的小鼠淋巴细胞活化和增殖都具有显著的抑制作用;细胞周期分析结果显示,Ber能明显阻止活化的淋巴细胞进入S期和G2/M期;Ber能显著抑制CHX诱导的淋巴细胞和胸腺T细胞的凋亡;并能显著抑制（LPS+IFN-γ）/（LPS+IFN-γ+ATP）诱导的NO的产生,呈剂量依赖性。 3.MCAO/R组小鼠相对于Normal组淋巴细胞的活化率降低、增殖不明显、细胞周期明显分布在G0/G1期;而对于淋巴细胞和胸腺细胞的凋亡、外周血中ROS水平、血清中的NO和H2O2水平、骨髓的NO产生等,MCAO/R组各项指标与Normal组相比有显著升高;而（M+Ber）组则有很大改善与Normal组、Sham组相近。 结论 MCAO/R组与Normal组相比,外周和中枢免疫系统的细胞（淋巴细胞、脾细胞和胸腺细胞）反应性都变差,凋亡细胞数增多,由此引起MCAO/R小鼠外周或中枢免疫器官的萎缩;且自由基如:ROS、NO和H2O2产生明显增多,加剧了脑损伤;而（M+Ber）组能显著抑制免疫细胞的凋亡,减少自由基的产生,改善免疫细胞的反应性,减轻免疫器官的萎缩。表明Ber对脑缺血再灌注小鼠的外周和中枢免疫系统都具有显著的保护作用。