小檗碱通过抑制脂肪组织巨噬细胞浸润改善胰岛素抵抗的研究

本课题基于2型糖尿病的中医病机“燥热内盛”及现代研究“炎症学说”的最新发展,把“燥热内盛”的中医理论与肥胖进一步发展成为胰岛素抵抗(IR)及2型糖尿病的研究相结合,提出肥胖的中医病机“燥热内盛”,采用“清热解毒”法治疗,达到降血糖、治疗2型糖尿病的目的。本研究选用临床常用的清热解毒药之一黄连的主要成分小檗碱(BBR)做为研究的代表药物,观察其对肥胖相关IR的影响。探讨IR相关2型糖尿病“燥热内盛”病机、“炎症学说”研究及“清热解毒”治法之间的联系,提出清热解毒方药的降糖机制。实验研究研究目的通过高脂喂养C57BL/61asc、鼠和培养RAW264.7巨噬细胞及诱导3T3-L1脂肪细胞,观察黄连的主要成分BBR对脂肪组织巨噬细胞浸润程度与肥胖相关胰岛素敏感性的影响。本课题研究了BBR降低肥胖小鼠体重、减少脂肪组织巨噬细胞浸润、改善IR的药理作用,丰富了中药单体减肥降糖的理论认识,对明确中医药降糖新作用有了进一步的认识。研究方法体内实验：1)建立高脂喂养C57BL/61asc小鼠,18周复制肥胖动物模型并评价胰岛素的敏感性指标,病理学采用HE染色法观察脂肪细胞大小并测量脂肪细胞直径,同时用小檗碱(BBR),同时选取罗格列酮(RSG)作为阳性对照药干预15天进行药效研究。2)采用流式细胞仪分析脂肪组织巨噬细胞(ATMs)数量并用western bloting检测脂肪组织炎症信号通路及胰岛素信号通路,采用real time PCR检测脂肪组织MCP-1、IL-6、TNF-α的基因表达。3)ELISA法检测C57BL/61asc、鼠血清的MCP-1含量。体外实验：1)培养RAW264.7巨噬细胞及诱导3T3-L1脂肪细胞。用葡萄糖氧化酶法观察10umol/L小檗碱干预巨噬细胞调节液对脂肪细胞糖消耗情况。2)采用western bloting法检测炎症信号通路JNK(Thr183/185)、NF-κB/P65、P-IKKβ(ser181)蛋白的磷酸化活化。3)采用trans well共培养系统,利用苏木精-伊红法对巨噬细胞进行染色,观察并统计3T3-L1脂肪细胞对RAW264.7巨噬细胞趋化数量,同时用ELISA法检测3T3-L1脂肪细胞上清MCP-1的含量。研究结果1、以TNF-α为代表的细胞因子能够激活脂肪细胞JNK、IKKβ炎症信号通路,促进细胞因子IL-6、INF-α及MCP-1的基因表达上调,增加Ser307蛋白磷酸化的活化,降低胰岛素的敏感性,使葡萄糖消耗下降。2、LPS促进JNK、IKKβ/NF-κB信号通路的活化磷酸化,使细胞因子IL-6、TNF-α及MCP-1基因表达上调,细胞表现为炎症状态。3、高脂饲料喂养18周的小鼠体重、血清MCP-1、FBG、FINS水平显著升高,HOMR指数>1,胰岛素敏感性降低。4、小檗碱可以抑制JNK、IKKβ/NF-κB炎症信号通路,抑制IL-6、TNF-α炎症因子及趋化因子MCP-1的基因表达,同时抑制了ATMs的浸润数量,抑制丝氨酸307位点(Ser307)蛋白磷酸化的活化,恢复了胰岛素信号蛋白的活性和转导,改善胰岛素抵抗。结论：小檗碱能够抑制脂肪组织巨噬细胞数量同时抑制炎症信号通路,改善胰岛素的敏感性。