背景:银屑病是常见的慢性炎症性、增殖性皮肤病,顽固、难治、易复发,目前尚缺乏理想的治疗方法。维A酸类药物是目前治疗银屑病的主要用药之一,临床疗效确切,但其抗病机制尚不完全明了,该药因严重的毒副作用限制了临床应用;中药治疗银屑病在我国历史悠久,主要治则是凉血、活血等。我院应用于银屑病的凉血活血复方秉承了传统中医理论及中医验方,具有凉血、活血、祛风、理湿等功效,经动物实验和初步的临床研究证实对银屑病有较好疗效。黄芪注射液含有黄芪的主要有效成分,现代药理学研究表明具有免疫增强和免疫调节作用。以往研究证明治疗银屑病有效,但其抗病机制尚不完全明了。
目的:本研究旨在比较维A酸类药物和传统中药方剂的临床疗效,并观察不同的维A酸类药物及中药复方和黄芪注射液联合应用对疗效的影响。在此基础上考查第二代维A酸(依曲替酸)和传统中药提取物黄芪注射液对体外培养的永生化人角质形成细胞株(HaCaT细胞)的增殖、凋亡及维生素D受体(VDR)表达的影响,探索银屑病的发病机制,明确维A酸类药物治疗银屑病的可能机制。同时对比分析维A酸类药物和传统中药的作用机理,为维A酸类药物与中药联合应用提供实验依据。
方法:(1)临床研究:选择经临床检查或皮肤病理活检确诊的银屑病患者272例,按入院或接诊时间分为三个治疗组。芳香维A酸乙酯治疗组41例口服芳香维A酸乙酯胶囊,依曲替酸治疗组66例口服依曲替酸胶囊,中药凉血活血复方治疗组165例口服凉血活血复方煎剂。同时各组内设部分患者联合应用黄芪注射液。采用国际通用的银屑病皮损严重程度评分(PASI)法判定临床疗效,对各组间的疗效进行比较,同时对各组内应用黄芪注射液者与未用者之间的疗效进行统计学分析。(2)实验研究:免疫组化法观察银屑病皮损和正常表皮角质形成细胞VDR蛋白表达情况,镜下计数阳性反应细胞数,采用半定量方法评价阳性反应程度,比较银屑病皮损和正常表皮VDR表达有无差异;将不同浓度的依曲替酸或黄芪注射液分别作用于体外培养的HaCaT细胞24h、48h、72小时。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测药物对细胞增殖的影响,计算生长抑制率及IC50;根据MTT结果分别选定两种药物适宜的作用浓度及时间作用于HaCaT细胞,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。于透射电镜下观察凋亡细胞形态,研究依曲替酸和黄芪注射液对HaCaT细胞周期及凋亡的影响;采用Western印记法半定量检测HaCaT细胞VDR蛋白表达水平,以阴性对照组VDR蛋白表达作为基准,计算各用药组VDR蛋白表达量的变化情况;Real-Time RT-PCR方法分析HaCaT细胞VDR mRNA相对表达量。
结果:①芳香维A酸乙酯治疗组、依曲替酸治疗组、中药凉血活血复方治疗组的总有效率分别为82.9%、78.8%和64.2%;各治疗组内联合应用黄芪治疗者有效率均高于未用黄芪者;芳香维A酸乙酯组和依曲替酸组的总有效率明显高于中药凉血活血复方组,芳香维A酸乙酯组和依曲替酸组间疗效没有显著性差异。②依曲替酸和黄芪均对HaCaT细胞增殖有明显的抑制作用,作用24、48、72小时,依曲替酸抑制HaCaT细胞增殖的IC50分别为47.80μg/ml、27.40μg/ml、18.46μg/ml;黄芪抑制HaCaT细胞增殖的IC50分别为341.0 mg /ml, 252.2 mg /ml, 194.3mg /ml。在一定浓度范围内其抑制率呈时间和剂量依赖性。③流式细胞仪检测结果显示,与阴性对照组相比,各浓度组依曲替酸G1期细胞百分比均明显增加,S期和G2期细胞百分比减少,HaCaT细胞明显阻滞于G1期。依曲替酸30μg/ml作用48小时有明显的凋亡峰出现。电镜下出现典型的凋亡细胞形态学特征。黄芪作用48小时各期细胞比例介于依曲替酸15μg/ml和30μg/ml之间。④免疫组化:镜下正常皮肤和银屑病皮损标本均见阳性染色的角质形成细胞,即正常皮肤和银屑病皮损都有VDR蛋白表达,银屑病皮损的表达水平明显强于正常皮肤标本(P<0.01)。阳性染色的细胞主要分布于基底细胞层,在银屑病皮损这种分布趋势尤其明显。⑤Western印迹实验:各组样品均出现β-肌动蛋白和VDR与其单克隆抗体结合产生的免疫印迹条带,大小分别为42 kDa和58 kDa。半定量分析结果显示依曲替酸作用后,HaCaT细胞VDR蛋白表达均较阴性对照组降低,而黄芪作用组VDR水平则与阴性对照组接近。⑥Real-Time RT-PCR方法:对样品中的目的基因(VDRmRNA)进行相对表达量分析,结果显示各用药组HaCaT细胞VDRmRNA的相对表达量与阴性对照组相比无明显差异,提示黄芪和各浓度依曲替酸均不能明显改变VDR mRNA的表达。
结论:①芳香维A酸乙酯胶囊、依曲替酸胶囊和中药凉血活血复方治疗银屑病均有较好疗效,其中维A酸类药物的疗效明显优于血活血复方,二代与三代维A酸间的疗效无显著性差异。黄芪与上述药物联合应用可提高疗效。②依曲替酸和黄芪均对HaCaT细胞增殖有明显的抑制作用,且在一定浓度范围内其抑制率呈明显的时间和剂量依赖性。二者亦可干扰HaCaT细胞周期,细胞阻滞于G1期,使之不能进入G2/M期进行分裂增殖;依曲替酸和黄芪作用于HaCaT细胞后均可诱导其凋亡,提示依曲替酸和黄芪的抗银屑病机制可能与此有关。③正常皮肤和银屑病皮损表皮都有VDR蛋白表达,银屑病皮损的VDR蛋白表达水平明显高于正常皮肤标本;银屑病皮损阳性染色的细胞明显集中分布于基底细胞层。提示表皮细胞VDR蛋白异常表达可能是银屑病的发病机制之一,同时也可能是1,25(OH)2D3衍生物治疗银屑病有效的分子基础。④依曲替酸可使HaCaT细胞VDR蛋白表达减少,但不改变VDRmRNA水平,分析可能是依曲替酸促进了HaCaT细胞VDR蛋白降解,或者依曲替酸激活RXR并与VDR形成异二聚体,从而下调VDR蛋白表达。这可能是维A酸类药物治疗银屑病的机制的机制之一。畸形的发生也可能与此机制有关。⑤黄芪注射液既不改变HaCaT细胞VDR蛋白表达,也不改变VDRmRNA的表达水平,推测其抗病机制与VDR无关。
