当归对小鼠骨髓细胞增殖的影响及相关细胞信号通路的研究

本论文研究中药，主要是当归对小鼠骨髓细胞增殖的影响，及对MAPK，JAK—STAT两条细胞信号通路的作用。 论文分为三部分内容。 第一部分是药物的选择和作用条件的优化。根据中药的药性，选择了4种有代表性的药物，即补血药当归，理气药黄芪，滋阴药枸杞和祛风湿药雷公藤。采用这4种药物的制剂，观察对小鼠骨髓细胞增殖的影响。 粒单核祖细胞集落形成及髓过氧化物酶活性测定结果表明，当归和黄芪提取物具有促进粒单核细胞系列增殖的能力。分别检测了0.1mg／ml，1mg／ml，10mg／ml 3个不同剂量，作用有量效关系。当归提取物的作用在10mg／ml剂量较强，能增加CFU-GM形成数73％，MPO比酶活369％；而黄芪提取物的作用在1mg／ml剂量较强，使CFU-GM形成数增加22％，MPO比酶活增加96％。 枸杞中的提取物——枸杞多糖在0.01mg／ml，0.1mg／ml，1mg／ml浓度未检测到对CFU-GM形成数和MPO比酶活的影响。 雷公藤制剂——雷公藤多苷的作用是抑制性的，以0.01mg／ml，0.1mg／ml，1mg／ml三个不同浓度进行研究，1mg／ml剂量作用较强，使CFU-GM形成数下降41％，MPO比酶活下降77％。 根据上述结果，从中选择具有良好促骨髓细胞增殖能力的当归进行作用条件优化，继而进一步深入研究。 以密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离出单个核细胞，采用噻唑蓝比色法测定其生长增殖能力。分别对细胞培养第1—7天每日测定，作出细胞生长曲线。结果表明，第3天是明显的快速增殖期，适合于进一步研究。 在新鲜分离的单个核细胞中加入不同浓度的当归注射液，比较细胞生长增殖速度的变化。结果发现，1mg／ml浓度具有较强的作用效果。 常规细胞培养液中的胎牛血清含有多种促进细胞生长的活性因子，可能掩盖药物作用，因此，在短期培养中目前有许多研究采用无血清培养。我们采用10％胎牛血清，5％胎牛血清，无血清3种不同条件的培养液，观察当归的作用。 实验结果表明，无血清条件下当归注射液呈现出明显的促进细胞增殖能力，在作用较强的1mg／ml剂量，能增加单个核细胞增殖444％。而在含10％胎牛血清及5％胎牛血清的培养液，当归的促增殖作用在很大程度上被细胞的背景增殖所掩盖。因此，在后面细胞信号通路的研究中，我们采用无血清或根据方法要求采用背景很低的0.5％血清。 论文的第二部分是当归制剂对单个核细胞增殖中MAPK信号通路的影响。 MAPK细胞信号通路是调节细胞生长增殖的一条重要途径，在细胞内信号传递中起枢纽性作用。它的核心过程是MAPKKK→MAPKK→MAPK的三级传递。MAPK有多种亚型，不同的亚型引起不同的细胞变化。ERK1／2，SAPK／JNK，P38是三种主要的亚型。 MAPK蛋白通过关键位点氨基酸的磷酸化而活化，这种变化可用特异性抗体加以检测。在本文中，采用流式细胞术方法研究MAPK蛋白的活化。