PCR-RFLP分析分枝杆菌Hsp65基因时三种凝胶电泳的比较研究及临床应用

随着影响免疫功能的疾病,如艾滋病和其他免疫缺陷患者的增多,分枝杆菌皮肤感染的发病率逐年增加。由于分枝杆菌感染的临床表现和组织病理缺乏特异性,诊断主要依靠检测到分枝杆菌。分枝杆菌菌种不同,治疗方法和感染控制措施办不相同,故需要有快速、准确的菌种鉴定方法,指导临床尽早做出处理方案。分枝杆菌的传统鉴定方法主要有表型鉴定和生化试验,耗时费力,有时结果模棱两可,不能及时、准确地为临床医生提供可靠的信息。 目前快速鉴定分枝杆菌的方法主要有细胞成分分析和基于聚合酶链反应(PCR)检测的分子生物学方法。其中多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)可以用一个单一的实验去鉴定所有各型分枝杆菌,可操作性强、廉价、准确,具有较好的应用前景。该方法首先用通用引物扩增各种分枝杆菌共同靶序列,然后用一种或几种限制性内切酶对扩增产物进行消化,不同分枝杆菌获得的酶切片段数目和分子大小不同,根据酶切图谱的差异,即可鉴别出不同种分枝杆菌。本方法无需特殊的仪器设备,可操作性强,耗时短,大多数实验室中均可进行。 检测分枝杆菌共同靶基因的方法有多种,其中以热休克蛋白(Hsp)65基因为靶序列的PCR-RFLP方法,操作步骤和结果分析较为简单,仅需2种内切酶,即可将分枝杆菌鉴定至种水平。理论上,Hsp65基因PCR-RFLP法可通过单一试验鉴定出所有分枝杆菌。但在实际操作过程中,我们发现有些菌种须通过小片段比较才能加以鉴别,一般琼脂糖凝胶分辨率低,很难满足要求,这时需要更高分辨率的凝胶。为此本研究我们选用分辨率比一般琼脂糖凝胶更高的两种凝胶,即非变性聚丙烯酰胺凝胶和Metaphor琼脂糖凝胶,进行比较研究,分析以上三种凝胶用于常见分枝杆菌酶切图谱的准确性和灵敏性,并结合可操作性和经济性,初步应用于部分临床标本的检测,试图找出一种较好的,适合我们现今条件的高分辨率凝胶来进行酶切图谱分析,为我们实验室分枝杆菌皮肤感染临床标本的检测和菌种鉴定方法的研究夯实基础。 第一章:PCR-RFLP分析分枝杆菌Hsp65基因时三种凝胶电泳准确性的比较研究。选取我们实验室现有的分枝杆菌标准株10株。沸水冻融法提取DNA,PCR扩增Hsp65基因,BstEⅡ和HaeⅢ限制性内切酶分别酶切,在相同标本浓度情况下,分别使用2%一般琼脂糖凝胶、2%Metaphor琼脂糖凝胶和10%非变性聚丙烯酰胺凝胶分析酶切图谱,以http://app.chuv.ch网站提供的酶切图谱为参照。结果,依据参照酶切图谱,10株标准株酶切应得57个片段,本实验用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶,共得54个酶切片段,3个酶切片段未显示。酶切片段大小与参照酶切片段相差小于等于5bp有42个,相差6～10bp有9个,相差11～15bp有1个,相差大于15bp有2个。2%Metaphor琼脂糖凝胶,共得50个酶切片段,7个酶切片段未显示。与参照酶切片段大小相差小等于5bp有31个,相差6～10bp有10个,相差11～15bp有8个,相差大于15bp有1个。2%一般琼脂糖凝胶,共得42个酶切片段,15个酶切片段未显示。与参照长度相差小于等于5bp有19个,相差6～10bp有13个,相差11～15bp有9个,相差大于15bp有1个。显示10%非变性聚丙烯酰胺凝胶产生的酶切片段大小更接近参照酶切片段大小,提示使用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶分析分枝杆菌酶切图谱较其他两种凝胶准确性高。 第二章:PCR-RFLP分析分枝杆菌Hsp65基因时三种凝胶电泳灵敏性的比较研究。取结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(细胞内分枝杆菌)标准株各1株,临床株各3株,分别制成10～6、10～5……10～1个菌细胞/mL浓度的菌悬液。沸水冻融法提取DNA,PCR扩增Hsp65基因,BstEⅡ和HaeⅢ限制性内切酶分别酶切,分别用2%一般琼脂糖凝胶、2%Metaphor琼脂糖凝胶和10%非变性聚丙烯酰胺凝胶分析酶切图谱。SPSS13.0软件One-Way ANOVA法分析三种方法结果间灵敏性的差异。实验结果显示2%一般琼脂糖凝胶方法的灵敏性明显低于2%Metaphor琼脂糖凝胶(P＜0.001),亦明显低于10%非变性聚丙烯酰胺凝胶方法(P＜0.001);然而2%Metaphor琼脂糖凝胶与10%非变性聚丙烯酰胺凝胶方法结果间无明显差异(P＞0.05)。提示使用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶和2%Metaphor琼脂糖凝胶分析分枝杆菌酶切图谱的灵敏性均高。 第三章:10%非变性聚丙烯酰胺凝胶分析Hsp65基因PCR-RFLP法检测可疑分枝杆菌皮肤感染临床标本的敏感性和特异性。根据上述两部分实验结果,本章节选用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行实验。共检测临床可疑分枝杆菌感染皮损标本20份,分别进行直接镜检、分离培养和PCR-RFLP检测,PCR-RFLP检测阳性的标本再经Hsp65基因和16S rRNA基因测序证实。结果20份皮损标本直接镜检均阴性,10份分离培养阳性。培养阳性的10份皮损标本中,PCR-RFLP检测3份阳性,初步鉴定为1份海分枝杆菌和2份结核分枝杆菌,与用Hsp65基因和16S rRNA基因测序所得结果相符;另外10份培养阴性的皮损标本中,PCR-RFLP检测结果均为阴性。结果显示Hsp65基因PCR-RFLP法检测分枝杆菌皮肤感染临床标本的敏感性为30%(3/10)、特异性为100%(10/10)。提示Hsp65基因PCR-RFLP的10%非变性聚丙烯酰胺凝胶法可初步用于分枝杆菌皮肤感染临床标本的检测。