姜黄素抑制肝星状细胞Hedgehog信号通路抗肝纤维化作用研究

[背景]肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理过程,当今医学界仍无有效的肝纤维化防治药物。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)活化并大量分泌细胞外基质成分是肝纤维化病理过程中的核心事件。因而药物抑制HSC活化是阻断肝纤维化进程并逆转肝纤维化的有效策略。新近研究发现,Hedgehog (Hh)信号通路的活化与肝纤维化病理进程高度相关,可能是全新的药物干预靶标。中药活性成分已成为当前抗肝纤维化候选药物的重要来源。本课题组对天然产物姜黄素在抗肝纤维化中的作用进行了长期研究,明确了姜黄素的体内外抗肝纤维化活性,发现阻断HSC胞内促纤维化信号转导通路是其抑制HSC活化的主要机制。在此基础上,本论文提出姜黄素通过调控Hh通路抑制HSC活化从而发挥抗肝纤维化的科学假说并对此进行实验研究。[方法]本文运用Western blot和免疫荧光实验检测蛋白表达；ELISA实验；Real-time PCR检测mRNA的表达；Brdu掺入实验；流式细胞仪检测细胞细胞周期和细胞凋亡实验；EMSA实验；油红O染色实验；Transwell小室实验；细胞划痕实验；ATP水平检测实验；酶活力检测；乳酸水平检测；流式细胞仪检测HSC细胞膜上Glut4的膜转位等实验方法。[结果]我们首先建立CCl4诱导大鼠肝纤维化模型并给予姜黄素治疗,发现姜黄素能够减少纤维化肝脏中Hh配体Shh的含量,下调Hh通路关键受体Patched和Smo的表达并上调Hh通路抑制因子Hhip的表达；体外实验发现,姜黄素除调控HSC中上述关键因子外,还抑制转录因子Gli1的核转位、与靶基因的结合能力及靶基因的表达。我们使用Hh通路特异性拮抗剂环杷明和激动剂SAG考察姜黄素调控Hh通路与抑制HSC活化的相关性。结果发现,环杷明与姜黄素一样,均能抑制HSC增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导HSC凋亡,恢复脂滴积聚并上调脂质基因的表达,减少纤维化标志物的表达,并抑制HSC的侵袭与迁移能力；而SAG则能削弱姜黄素的这些作用。活化的HSC转变为增殖能力很强的肌成纤维样细胞时,细胞内的能量代谢方式可能依赖于糖酵解途径并且与其活化存在一定关联。我们发现,以糖酵解抑制剂2DG和乳酸脱氢酶抑制Galloflavin分别干扰糖酵解过程的不同环节,均显著降低HSC中纤维化标志物的表达,恢复脂滴积聚并上调脂质基因的表达,这提示糖酵解活性的上调可能是维持HSC活化重要条件。在此基础上,我们体内外实验发现姜黄素对HSC中糖酵解过程中一些列关键分子的表达具有抑制作用；环杷明也可产生类似的作用,而SAG则削弱姜黄素对糖酵解的抑制作用。这些结果提示,姜黄素通过阻断Hh信号通路抑制了HSC内的糖酵解过程。[结论]以上这些结果表明姜黄素通过阻断Hh通路抑制HSC活化的生物学行为；姜黄素通过阻断Hh信号通路抑制了HSC内的糖酵解过程。本论文研究确证了Hh信号通路在姜黄素抑制HSC活化抗肝纤维化中的重要作用,初步揭示了其中的调控机制,为靶向于Hh通路的抗肝纤维化药物研究提供实验依据。