灵芝深层发酵水溶性活性物质的研究

本论文主要对灵芝深层发酵蛋白酶A抑制剂的分离纯化、基本特性、结构与功能的关系、产生的基本条件、纯生啤酒中的应用等方面进行了研究。 灵芝深层发酵水溶性活性物质初步分离研究发现:灵芝深层发酵也能产生SOD,且菌丝体中的含量明显高于发酵液,4℃半衰期为7d,相对表观分子量为35000。 灵芝发酵全粉抽提液中分离得两种蛋白酶A抑制剂GLPIA1和GLPIA2,建立的纯化工艺为:乙醇分级沉淀（30～80%）、Ultrogel AcA44凝胶层析、Source 30Q离子交换层析。 SDS-PAGE和凝胶过滤测定GLPIA1相对表观分子量为38000;GLPIA1的热稳定性较高,80℃保温30分钟,仍保留95%以上的活性,98℃也仅丢失约9%的抑制活性;GLPIA1的pH稳定范围为3.0～7.5; GLPIA1对几种蛋白酶都表现出一定的抑制作用,且对两种天冬氨酸族蛋白酶有相对较高的抑制活性;GLPIA1对蛋白酶A作用时,Ki值为2.2×10-6,抑制效果最强,其次是胃蛋白酶,GLPIA1对蛋白酶A的IC50为0.16mg/ml;动力学研究（Lineweaver-Burk作图法）发现,GLPIA1是蛋白酶A的非竞争性抑制剂。 蛋白酶A抑制剂被两种蛋白酶协同水解或被β-1,3葡聚糖酶水解后,抑制作用都出现大幅度的下降,说明GLPAI1肽链或糖链部分发生降解对其抑制活性有较大影响;GLPIA1中亚氨基酸（脯氨酸）和酸性氨基酸的含量相对较多（分别接近11%和27%）;气相色谱分析GLPIA1糖链组成中含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖四种单糖,其中葡萄糖的含量为96%;β-消去反应前后的紫外扫描和氨基酸组成比较结果表明:GLPIA1中的糖苷键为O型糖苷键。 GLPIA1的红外吸收图谱及核磁共振图谱结果说明:GLPIA1是一个典型的多糖与蛋白质的复合物,多糖中含有β糖苷键;GLPIA1侧链存在少量β1,6-糖苷键,结合红外与气相的结果,推测此糖蛋白的糖链主要由β-D-葡萄糖以β-1,3糖苷键相连,存在极少量的分支,分支点为β1,6-糖苷键。 据GLPIA1与刚果红复合物及单纯刚果红溶液在不同NaOH浓度下λmax的变化,得出GLPIA1分子存在三股螺旋构象;不同浓度碱处理又中和透析过的GLPIA1在不同浓度下进行蛋白酶A抑制活性分析,抑制活性的变化与糖链构象变化相对应,证实GLPIA1空间结构与其抑制活性存在密切关系。 灵芝发酵全粉抽提液中另一种蛋白酶抑制剂GLPIA2,仅在215有紫外吸收;GLPIA2的酸性氨基酸较高,三种芳香族氨基酸Trp,Phe和Tyr的含量很低。SDS-PAGE测定其相对表观分子量为15000;GLPIA2对胃蛋白酶和酵母蛋白酶A的抑制作用相对较强,比抑制活力分别为14.96 u/mg与10.84u/mg;抑制剂对胃蛋白酶和蛋白酶A的Ki分别为1.52×10-7mol/L和1.34×10-6 mol/L;GLPIA2对胃蛋白酶的半抑制浓度IC50值为0.18mg/ml,对蛋白酶A的半抑制浓度IC50值0.29 mg/ml;GLPIA2是胃蛋白酶和蛋白酶