连花清瘟颗粒抗流感病毒及调节相关免疫反应的药效和机制研究

实验目的连花清瘟由连翘、炙麻黄、金银花、杏仁、薄荷、绵马贯众、红景天、石膏、广藿香等药物组成,临床常用于呼吸道感染相关疾病的预防和治疗。连花清瘟的组方来源于传统中药方剂银翘散和麻杏石甘汤。银翘散出自清代吴鞠通的《温病条辨》,是辛凉解表的代表方剂,用于温病初起,“太阴风温,温热,温疫,冬温……但热不恶寒而渴者,辛凉平剂银翅散主之”。其组方依据来源于《内经》“风淫于内,治以辛凉,佐以苦甘”之说。连花清瘟颗粒组方独特,有确切的临床疗效,已被广泛地应用于包括甲型流感病毒感染在内的多种流感病毒感染引起的呼吸系统疾病,在对治疗甲型H1N1流感病毒的随机对照试验显示了良好的治疗效果,是目前我国为数不多的完成了循证医学研究的中成药,但目前针对连花清瘟颗粒抗病毒的药理机制研究多停留于药效层面。为了进一步阐明板蓝根的抗病毒物质药效及药理作用机制,本课题采用多种实验开展抗病毒机制研究。同时以小鼠感染模型验证连花清瘟颗粒有效成分的体内药效。实验方法1.采用空斑减少实验及TCID50实验,观察连花清瘟颗粒对多种流感病毒亚型的抑制作用,及其不同作用模式对其药效的影响。2.利用时间点试验探讨连花清瘟颗粒对流感复制周期的作用环节。3.采用血凝抑制实验、溶血抑制试验及唾液酸抑制实验,研究连花清瘟颗粒对病毒复制的早期阶段的作用机制。4.采用蛋白质免疫印迹法(Western-blot),检测宿主相关信号通路中关键蛋白表达量的变化,探讨了药物对宿主相关信号传导的调节作用。5.通过Realtime-PCR实验,测定感染细胞IL-8, MCP-1, IP-10, TNF-α, IL-6 mRNA表达量的变化,探讨连花清瘟颗粒对NF-kB通路介导相关炎症因子表达的调节作用。6.运用Western Blot实验,测定连花清瘟对信号通路及凋亡相关蛋白Caspase3、PARP的表达水平。从而分析药物对病毒感染后细胞凋亡的影响。7.小鼠感染模型验证连花清瘟颗粒有效成分的体内药效：7.1.记录各组小鼠体重改变及死亡情况,观察连花清瘟颗粒对病毒感染小鼠体重变化的影响。7.2.各组小鼠分别于感染后第2、4、6、8天,解剖取材,在MDCK细胞上检测小鼠肺组织病毒滴度；7.3. Realtime-PCR法检测小鼠肺内相关细胞因子mRNA表达量的变化情况,讨论连花清瘟颗粒对流感介导相关细胞因子表达的影响。7.4.各组小鼠分别于感染后第4、6天,解剖取肺,观察小鼠肺病理改变。实验结果1.连花清瘟颗粒对包括高致病性禽流感(H7N9)在内的多种人源、禽源流感病毒都有明显的抑制作用。其中,连花清瘟颗粒对H3N2病毒A/Aichi/2/68株抑制作用最强(SI=15.85)。在不同给药模式的实验中,直接作用模式下,药物对病毒都有非常显著抑制(P<0.005)。空斑减少实验结果显示药物在2mg/mL浓度下可明显抑制病毒空斑形成,显示与TCID50相类似的药效结果。2.连花清瘟颗粒各剂量对于H1N1、H3N2、H9N2病毒的凝血现象均无明显抑制作用,溶血试验亦显示阴性,提示药物对病毒血凝素并无抑制作用。3.利用时间点试验探讨连花清瘟颗粒对流感复制周期的作用环节。研究发现,连花清瘟颗粒作用于病毒复制的早期阶段(0-4小时)。通过干预流感病毒早期蛋白NP的表达及核输出。4.连花清瘟颗粒各剂量组均可上调明显抑制NF-κB通路p65蛋白的磷酸化,而对ERK通路ERK1/2蛋白的磷酸化无明显抑制作用,提示连花清瘟颗粒对NF-κB通路有明显抑制作用,提示药物的抗病毒作用可能与对NF-κB通路抑制有关。5.高剂量的连花清瘟颗粒(3mg/mL)可以显著抑制TRAIL分子在细胞内的表达,药物抑制Caspase-3的活化的同时,同样也抑制了PARP(poly-(ADP-ribose)-polymerase)的表达。提示连花清瘟颗粒对流感病毒诱导凋亡有较好的抑制作用。6.连花清瘟颗粒3mg组对IL-8, MCP-1, IP-10 mRNA表达有非常显著的抑制(P<0.05),对TNF-α, IL-6 mRNA表达抑制效果显著(P<0.01),连花清瘟颗粒2mg,2.5mg组对TNF-α, MCP-1, IP-10都有不同程度的抑制。表明连花清瘟颗粒能明显降低流感介导的相关炎症表达。7.体内实验结果显示,连花清瘟高剂量组的各时间点肺组织病毒滴度与病毒组相比均有下降,其中第6天较病毒组明显下降,P<0.05,第8天,连花清瘟高剂量组已无法检测出活毒。表明连花清瘟高剂量可有效的抑制流感病毒在小鼠体内的复制。与病毒组相比,连花清瘟颗粒组可见TNF-α, IL-6, MCP-1, IP-10表达量显著降低。药物高剂量组肺泡内炎性渗出物明显减少,肺泡浸润不明显,较病毒组肺泡浸润面积明显减轻；低剂量组肺部仍可见肺泡病变,较病毒组炎性病变减轻,可见部分出现浸润及炎性病变,较病毒组炎性病变减轻。实验结论1.连花清瘟胶囊对包括禽流感在内的多种流感病毒亚型都有明显抑制效果。2.连花清瘟胶囊可能通过抑制病毒复制早期及RNP的核输出抑制病毒的复制。3.药物可通过抑制NF-κB通路参与调节宿主免疫调节,并抑制过高的细胞因子表达(IL-6, IP-10),并抑制病毒复制导致的宿主细胞凋亡。4.连花清瘟颗粒在感染后期有效降低小鼠肺中的病毒滴度。5.连花清瘟颗粒主要通过早期抑制相关炎症因子的表从而减轻感染所致的炎症改变。