甘草附子汤药效物质基础研究

本研究以《伤寒论》中祛风除湿的经典名方甘草附子汤为研究对象，对其药效物质基础进行了一系列研究。 对甘草附子汤的提取溶剂进行了优化，选择巴豆油致小鼠耳肿胀反应和醋酸致小鼠扭体反应两个模型分别作为抗炎和镇痛药理指标，考察了水、30％、50％、70％和95％乙醇五种提取溶剂，结果表明以50％乙醇提取效果较好，抗炎和镇痛抑制率分别达到27.5％和69.6％。以甘草附子汤50％乙醇提取液在2.5、5、10g／kg三个剂量灌胃给药，抗炎抑制率达到15.6％-46.2％，镇痛抑制率达到52.8％-79.8％，且表现出了良好的量效关系，说明甘草附子汤具有良好的抗炎和镇痛作用。 从甘草附子汤君、臣、佐、使配伍关系出发，利用正交实验设计，对甘草附子汤进行拆方研究，探讨甘草附子汤配伍机制。选择L16（4～5）正交表，以甘草附子汤中4味药为因素，分别选取原方0、0.5、1、2倍量构成4个水平。对所得16个处方分别进行药理实验；采用直观分析、方差分析和逐步回归分析，将所得药理数据和处方组成相关联，探讨甘草附子汤的配伍机制。结果确证了方中以甘草为君，以附子为臣，白术为佐，桂枝为使的配伍关系，与甘草附子汤的传统方解相一致。 利用RP-HPLC梯度洗脱技术，对16个处方进行了分析，共得到26个色谱峰。将药理数据和各指纹峰峰面积相关联，通过逐步回归分析方法处理，共有14个色谱峰被引入到回归方程。表明这14个色谱峰所代表的化学成分对其药效有显著作用，确定为甘草附子汤的药效物质基础。 对甘草附子汤的提取工艺进行了优化研究。选取浸膏得率、甘草酸含量和桂皮酸含量三个指标，对溶剂量、提取时间、提取次数三个因素进行考察，确定甘草附子汤最佳提取工艺为以10倍量50％乙醇提取2次，每次1h。 采用反相高效液相色谱法对甘草附子汤中甘草酸、桂皮酸、甘草苷和香豆素等4种成分进行了定量分析。采用Hypersil C18柱，在254nm检测，其中甘草酸以甲醇：乙腈：水：冰醋酸（19：30：51：1）为流动相，在0.055～1.10mg·mL-1范围内成良好线性关系，r=0.9999，平均回收率为95.9％。桂皮酸以甲醇：乙腈：水：冰醋酸（37：1：63：0.3）为流动相，在2.0～30.1μg·mL-1范围内成良好线性关系，r=0.9998，平均回收率为94.8％。甘草苷和香豆素以甲醇：乙腈：水：冰醋酸（5∶15∶80∶1）为流动相，分别在20～300μg·mL-1和1.7～16.7μg·mL-1范围内成良好线性关系，相关系数均为0.9999，回收率分别为95.9％和95.9％。方法简便、准确，为甘草附子汤质量控制方法提供了定量依据。 建立了大鼠血浆中甘草酸及其代谢产物甘草次酸的RP-HPLC测定方法，以联苯和苯丙酸诺龙为内标，血浆样品经异丙醇-乙醚（1∶1）萃取后取上清液，氮气吹干，甲醇定容后分析。使用Hypersil C18色谱柱，测定甘草酸时采用流动相：甲醇-乙腈-水-冰醋酸=24∶29∶47∶1；测定甘草次酸时采用甲醇-乙腈-水-冰醋酸=58∶18∶24∶1；流速0.8 mL·min-1；检测波长254 nm。结果表明，甘草酸在1.25～200μg·mL-1范围内线性关系良好（r=0.9942）；甘草次酸在0.506～81μg·mL-1范围内线性关系良好（r=0.9936）。低、中、高浓度的甘草酸和甘草次酸日内、日间精密度均小于10.7％。甘草酸和甘草次酸的回收率分别高于94.7％和88.9％。 研究了大鼠口服甘草附子汤和甘草酸后甘草酸的药物动力学行为，结果表明甘草酸在体内以代谢物甘草次酸的形式存在。给药甘草附子汤和甘草酸后甘草次酸的Tmax分别为10.4±0.9 h和11.2±1.1 h，Cmax分别为1.40±0.40μg·mL-1和1.64±0.77μg·mL-1。二者没有显著差异。AUC0～t分别为43.8±7.8μg·h·L-1和24.0±11.6μg·h·L-1，AUC0～∞分别为122.8±46.7μg·h·L-1和40.9±9.6μg·h·L-1，MRT分别为27.6±1.6 h和15.0±2.0 h。说明甘草在配伍附子、白术、桂枝后，有利于甘草次酸在体内的吸收，使其生物利用度增加，作用时间延长。 以甘草附子汤中君药甘草为研究对象，对其进行了血清药理学研究。选择一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）两个指标，考察大鼠口服甘草后不同时间点（1 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h和24 h），不同浓度（0.1％、1％、5％）的血清对LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞NO和TNF-α释放的影响。结果表明，低浓度（0.1％）和中浓度（1％）的血清可以显著降低NO和TNF-α的释放。随着给药剂量的增加，其作用发生翻转，高浓度（5％）的血清可以增加NO和TNF-α的释放。口服甘草后对NO和TNF-α表现出了双向调节的作用，且对二者的作用趋势相似。揭示甘草对炎症的调节作用机理可能是通过调节TNF-α的产生，进而影响NO合酶（iNOS）的活性、调节NO的释放而达到的。 在对大鼠血清的LC-MS分析中共检测出9个色谱峰。逐步回归分析结果表明，化合物3、6、7、9和化合物1、2、5、7、8、9分别对NO和TNF-α的产生有显著影响，综合作用表现出对二者的双向调节作用。确定为甘草在体内发挥药效的物质基础。 本研究在中医药学理论和实践的指导下，将中药学、分析化学、药理学、药物动力学、化学计量学和计算机技术相结合，对传统复方甘草附子汤进行了现代化研究，为复方中药的药效物质基础研究做了有意义的探索。