TRIB3基因沉默改善2型糖尿病大血管病变的实验研究

研究背景 糖尿病的发病率逐年增高,在发达国家已被列为继心血管疾病及肿瘤之后的第三大疾病。研究结果显示,糖尿病患者的医疗服务使用是非糖尿病患者的3至4倍(包括门诊和住院次数)；糖尿病患者的医疗支出是同年龄、同性别无糖尿病患者的9倍。另一项研究显示,我国糖尿病患者医疗花费中,只有不到20%是用于控制血糖,超过80%的费用是治疗糖尿病引起的并发症。目前糖尿病对人类健康危害最大的是在动脉硬化及微血管病变基础上产生的多种慢性并发症。糖尿病患者的血管病变发病率是非糖尿病患的2至4倍。现有研究证实,糖尿病血管病变的基本病理基础为动脉粥样硬化及血管平滑肌细胞和成纤维细胞大量增殖所致的动脉中膜、外膜不规则增厚、纤维化和钙化。UKPDS研究证实,严格控制血糖可以明显降低糖尿病患者微血管病变的发生率。由此,奠定了糖尿病血管并发症的防治基础。然而,2008年相继揭晓的三项重要强化降糖试验(ACCORD.ADVANCE及VADT)显示,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但却未能证实强化降糖治疗可降低2型糖尿病患者大血管事件发生率。因此,亟需深入探索糖尿病患者心血管并发症风险增高的深层机制,奠定糖尿病患者心血管事件源头性防治的理论基础。 胰岛素抵抗贯穿于糖尿病的整个病程。UKPDS资料表明,在血糖未明显升高以前,单胰岛素抵抗就可引起大血管病变。胰岛素抵抗是糖尿病代谢性异常和心血管疾病的原始动因和致病基础。胰岛素抵抗的选择性使血管平滑肌和成纤维细胞增殖增强。“选择性胰岛素抵抗”的研究指出,在胰岛素抵抗状态下,MAPK增殖通路活性明显增强,而Akt代谢通路显著受损。TRIB3作为Akt和MAPK共同的调节蛋白,与“选择性胰岛素抵抗”密切相关。因此,我们推测TRIB3不仅通过Akt信号途径引起胰岛素抵抗和参与糖尿病发病,并可能通过调控Akt及MAPK信号途径而影响糖尿病大血管病变的发生和进展。因此,本课题将建立2型糖尿病大血管病变大鼠模型,采用RNAi技术,构建能够在哺乳动物细胞中表达siRNA的腺病毒表达载体,诱导TRIB3基因沉默,研究TRIB3在糖尿病大血管病变发生发展中的作用,综合运用各种病理学组织学染色技术研究TRIB3基因沉默后大血管形态结构的变化。通过分析上述实验结果,探讨TRIB3在糖尿病大血管病变中的作用及其可能机制。这些结果将为糖尿病心血管并发症患者的早期防治提供新靶点,具有重要的学术理论意义和潜在的临床应用价值。 研究目的 1.探讨高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病大血管病变大鼠动物模型的可行性； 2.2型糖尿病大血管病变大鼠体内转染TRIB3-shRNA腺病毒,观察糖尿病大血管病变改善情况； 3.在细胞分子水平、组织学水平和整体功能水平研究TRIB3基因沉默改善2型糖尿病大血管病变的机制；研究方法 1.5周龄健康雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠60只,行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)及腹腔胰岛素耐量试验(IPITT)后随机分为4组：对照组(Control组)、普通饮食STZ组(Chow+STZ组)、高脂高糖饮食组(HF组)、DM组(DM组)。Control组和Chow+STZ组大鼠喂以基础饲料,主要组成为20%粗蛋白,3%粗脂肪,3%粗纤维,其他74%(包括碳水化合物、微量元素等)。HF组和DM组大鼠喂以高糖高脂高热量饲料,主要成分为34.5%脂肪、17.5%蛋白质、48%碳水化合物。4周后再次行IPGTT及IPITT,DM组大鼠出现胰岛素抵抗者给予一次性腹腔注射STZ27.5mg/kg,同时Chow+STZ组大鼠给予一次性腹腔注射STZ27.5mg/kg。 Control组和HF组大鼠给予同等剂量枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。各组以原饲料继续喂养1周后,留取静脉血,测定空腹血糖(FBG)和空腹胰岛素(FINS),计算胰岛素敏感指数(ISI, ISI=Ln(FINS×FBG)-1)。连续两次空腹血糖≥11.1mmol/L,胰岛素敏感指数降低且有多尿、多饮、多食现象的大鼠作为成模大鼠纳入实验； 2.5周龄健康雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠30只,糖尿病造模过程同上,造模成功后随机分为DM-Vector组和DM-siRNA组。糖尿病成模12周后,DM-siRNA组大鼠经颈静脉注射pAdxsi-TRIB3-shRNA腺病毒2.5×1010PFU/只,DM-Vector组注射pAdxsi空病毒载体2.5×1010PFU/只,2周后补充注射一次,剂量同第一次,腺病毒注射4周后处死动物留取标本。 3.腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)及腹腔胰岛素耐量试验(IPITT):大鼠禁食12h后(禁食不禁水),断尾取血测定空腹血糖,继而给予腹腔注射20%葡萄糖(1g葡萄糖/kg体重),于注射葡萄糖后15min、30min、60min、120min按时从尾静脉取血测定血糖水平。采用强生稳步血糖仪和试纸条测定血糖。通过IPGTT结果计算血糖曲线下面积(AUC of glucose, AUCg).大鼠禁食4h后(禁食不禁水)行IPITT,给予腹腔注射胰岛素(1U胰岛素/kg体重),余同IPGTT； 4.血液生化指标的测定：检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)的水平,测定血糖和血清胰岛素,计算胰岛素敏感指数； 5.血流动力学监测：所有实验动物通过大鼠尾动脉血压测量仪监测血压和心率； 6.腹主动脉超声：采用二维、脉冲多普勒和背向散射积分等超声技术,连续观察2型糖尿病大血管病变发生和发展过程中腹主动脉结构和功能的变化； 7.病理学检测：对大鼠主动脉组织分别进行HE染色、Masson染色、天狼猩红染色以及Verhoeff染色,应用图象分析仪测定主动脉中层厚度,主动脉血管周围胶原面积/管腔面积,主动脉中膜胶原比例,主动脉中膜弹力纤维比例,主动脉胶原与弹力纤维的比值,计算平均主动脉壁结构积分； 8.免疫组织化学染色：应用免疫组织化学染色法,光镜下观察大鼠主动脉间质的Ⅰ型胶原、Ⅱ工型胶原分布情况； 9.大鼠主动脉羟脯氨酸含量测定：将干燥至恒重的大鼠主动脉组织称重后置于6mol/L HCl中110℃水解16h,应用ELISA试剂盒测定水解物中羟脯氨酸的含量。因羟脯氨酸在胶原组织中占13.5%,所以最终结果显示为胶原含量(ug/mg主动脉干重)； 10.实时定量RT-PCR检测：取新鲜大鼠主动脉组织,Trizol法提取RNA,实时荧光定量RT-PCR技术检测TRIB3mRNA相对表达量； 11Western blot检测：取新鲜大鼠主动脉组织,提取蛋白,Western blot检测主动脉组织内TRIB3、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、磷酸化及非磷酸化的MKK4、JNK、PI3K、Akt的蛋白表达量。 结果 1、实验末各组大鼠的一般状况比较：与Control组大鼠相比,Chow+STZ组大鼠日饮水量、日摄食量及24h尿量均明显增加(P<0.05)；与Control组大鼠相比,HF组大鼠体重明显增加,日饮水量、日摄食量及24h尿量均有所增加(P<0.05)；与Control组大鼠相比,DM组大鼠日饮水量、日摄食量及24h尿量均显著增加(P<0.01)。与HF组大鼠相比,Chow+STZ组大鼠日饮水量、24h尿量明显增多(P<0.05～0.001)；与HF组大鼠相比,DM组大鼠日饮水量、日摄食量及24h尿量均显著增加(P<0.001)；与Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠日饮水量、日摄食量及24h尿量均明显增加(P<0.001)。 2、实验期间各组大鼠腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)及腹腔胰岛素耐量试验(IPITT)结果分析： (1)IPGTT结果分析： DM组大鼠高脂高糖饮食4周后与高脂高糖饮食前IPGTT结果显示：与高脂高糖饮食前相比,DM组大鼠高脂高糖饮食4周后在IPGTT试验Omin、30min、60min、120min的血糖值均明显升高,差异具有统计学意义(P均<0.05)；血糖曲线下面积(AUCg)明显增大(P<O.05)。 2型糖尿病成模后12周各组大鼠IPGTT结果显示：与Control组大鼠相比,Chow+STZ组大鼠在IPGTT试验30min及60min的血糖值明显升高(P<0.05)；与Control组大鼠相比,HF组大鼠在IPGTT试验各时间点血糖值差异无统计学意义：与Control组大鼠相比,DM组大鼠在IPGTT试验15min、60min的血糖值均显著升高(P<O.01)。与Chow+STZ组相比,HF组大鼠在IPGTT试验各时间点血糖值差异无统计学意义；与Chow+STZ组相比,DM组大鼠在IPGTT试验15min的血糖值显著升高(P<0.05)。与HF组相比,DM组大鼠在IPGTT试验120min的血糖明显升高(P<O.05)。与Control组相比,Chow+STZ组及DM组的血糖曲线下面积均明显增大(P<0.05～0.01)。 实验末IPGTT试验结果显示：与Control组大鼠相比,Chow+STZ组大鼠在IPGTT试验60min、120min的血糖值均显著升高(P<0.05)；与Control组大鼠相比,HF组大鼠在IPGTT试验各时间点血糖值差异无统计学意义；与Control组大鼠相比,DM组大鼠在IPGTT试验15min、60min、120min的血糖值均显著升高(P<0.05)。与Chow+STZ组相比,DM组大鼠在IPGTT试验15min、30min的血糖值明显升高(P<0.05)。与HF组相比,DM组大鼠在IPGTT试验60min、120min的血糖明显升高(P<0.05)。与Control组相比,Chow+STZ组、HF组及DM组的血糖曲线下面积(AUCg)均明显增大(P<0.05)。与HF组大鼠相比,DM组血糖曲线下面积明显增大(P<0.05)。 (2)IPITT结果分析： DM组大鼠高脂高糖饮食4周后与高脂高糖饮食前IPITT结果显示：与高脂高糖饮食前相比,DM组大鼠高脂高糖饮食4周后在IPITT试验Omin、15min、30min、60min、120min的血糖值均显著升高(P<0.05)；血糖曲线下面积明显增大(P<0.01)。 2型糖尿病糖尿病成模后12周各组大鼠IPITT结果显示：与Control组大鼠相比,Chow+STZ组大鼠IPITT试验15min、30min、60min及120min的血糖值明显升高(P<0.05～P<0.01)；与Control组大鼠相比,HF组大鼠在IPITT试验Omin、15min、30min、60min及120min的血糖值均显著升高(P<0.05～P<0.01)；与Control组大鼠相比,DM组大鼠在IPITT试验Omin、15min、30min、60min及120min的血糖值均显著升高(P<0.05～P<0.01)。与Chow+STZ组相比,HF组大鼠在IPITT试验各时间点血糖值差异无统计学意义；与Chow+STZ组相比,DM组大鼠在IPITT试验各时间点血糖值差异无统计学意义。与HF组相比,DM组大鼠在IPITT试验Omin、15min、30min、60min的血糖值均显著升高(P<0.05)。与Control组相比,Chow+STZ组、HF组及DM组的血糖曲线下面积均明显增大(P<0.05～P<0.01)；与HF组大鼠相比,DM组血糖曲线下面积明显增大(P<0.05)。 实验末IPITT试验结果显示：与Contro1组大鼠相比,Chow+STZ组大鼠IPITT试验15min的血糖值明显升高(P<0.05)；与Control组大鼠相比,HF组大鼠在IPITT试验各时间点血糖值差异无统计学意义；与Control组大鼠相比,DM组大鼠在IPITT试验15min、60min、120min的血糖值均明显升高(P<0.05)。与Chow+STZ组相比,DM组大鼠在IPITT试验各时间点血糖值差异无统计学意义。与HF组相比,DM组大鼠在IPITT试验各时间点血糖值差异无统计学意义。与Control组相比,Chow+STZ组、HF组及DM组的血糖曲线下面积均明显增大(P<0.05)。与HF组大鼠相比,DM组血糖曲线下面积明显增大(P<0.05)。 3、生化指标的测定：实验前各组大鼠生化指标无明显差异；高脂饮食4周后,与Control相比,HF组及DM组血清TG、FFA及FINS均明显升高(P<0.05),ISI明显降低(P<0.05),FBG无显著变化,提示注射STZ前DM组大鼠已存在胰岛素抵抗；STZ注射后一周,与Control相比,Chow+STZ组及DM组FBG明显升高(P<0.05),ISI显著降低(P<0.05),HF组及DM组血清TG、FFA明显升高(P<0.05),FINS无显著差异；糖尿病成模后12周,与Control相比,DM组FBG明显升高(P<0.05),ISI显著降低(P<0.05),DM组血清TC、TG、FFA明显升高(P<0.05),FINS无显著差异；糖尿病成模后14周,与Control相比,DM组血清TC、TG、FFA明显升高(P<0.05),ISI显著降低(P<0.05),FINS无显著差异；实验末,与Control相比,DM组血清TC、TG、FFA及FBG均显著升高(P<0.05),ISI明显降低(P<0.05)。结果提示,本研究以高脂饮食诱导联合小剂量链脲佐菌素注射建立的2型糖尿病动物模型,具有中度胰岛素抵抗,中度高血糖、高血脂等表现,基本符合2型糖尿病的临床特点。 4、血压及心率监测：实验过程中各组大鼠收缩压、舒张压及平均动脉压均无差异；实验末,与Control组大鼠及Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠心率略有增加,但是差异没有统计学意义。 5、腹主动脉超声监测 实验结束时,与Control组大鼠比较,HF组大鼠各项指标变化均无统计学意义；与Control组大鼠相比,Chow+STZ组大鼠腹主动脉Peterson弹性模量、僵硬度指数均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05～0.001),舒张末期流速、横断面扩张系数均降低,差异具有统计学意义(P<0.05～0.001,)；与Control组大鼠相比,DM组大鼠腹主动脉收缩期内径、舒张期内径、Peterson弹性模量、僵硬度指数均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05～P<0.001),收缩期峰值流速、舒张末期流速、横断面扩张系数均降低,差异具有统计学意义(P<0.05～0.001)。与HF组大鼠相比,Chow+STZ组大鼠腹主动脉僵硬度指数明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01)；与HF组大鼠相比,DM组大鼠腹主动脉舒张期内径、Peterson弹性模量、僵硬度指数均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05～P<0.001),收缩期峰值流速、舒张末期流速均降低,差异具有统计学意义(P<0.05～P<0.001)。与Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠腹主动脉收缩期内径和舒张期内径明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05～0.001)。余各组大鼠指标比较,差异均无统计学意义。 实验结束时,超声背向散射积分结果显示,与Control组大鼠比较,Chow+STZ组和DM组大鼠腹主动脉校正平均背向散射积分(IBS%)均明显增加(P<0.01)；与Control组大鼠比较,Chow+STZ组、HF组和DM组大鼠腹主动脉背向散射积分周期变化幅度(CVIB)均明显降低(P<0.001)；与HF组比较,Chow+STZ组和DM组大鼠腹主动脉IBS%明显增加(P<0.05～0.01),DM组大鼠腹主动脉CVIB明显降低(P<0.01)。 6、主动脉病理学分析 (1)主动脉HE染色,与Control组大鼠相比,DM组大鼠内皮细胞排列紊乱、致密,仍紧贴于内弹力板上。血管平滑肌细胞肥大、扭曲、排列紊乱,层数增多,细胞核大小不一,细胞膜及核膜欠清晰、完整,胞浆染色不均,可见大量肌纤维断裂。定量分析结果显示：与Control组大鼠相比,Chow+STZ组、HF组、DM组大鼠主动脉中膜厚度明显增加,差异具有统计学意义(72.73.09±2.12vs.58.09±0.97μ m,P<0.01；62.69±0.67vs.58.09±0.97μ m,P<0.05；72.38±2.30vs.58.09±0.97μ m,P<0.001)；与HF组大鼠相比,Chow+STZ组、DM组大鼠主动脉中膜厚度略有增加,差异具有统计学意义(P<0.05)；与Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠主动脉中膜厚度略有增加,差异无统计学意义。 (2)Masson染色显示,大鼠主动脉血管平滑肌细胞及弹力纤维呈红色,间质胶原纤维呈蓝绿色。Control组大鼠主动脉胶原纤维分布均匀、纤细,相邻细胞的胶原纤维网完好,血管周围纤维化程度很轻；与Control组相比,DM组大鼠主动脉胶原组织明显增多,排列紊乱,分布不匀,血管周围纤维化明显。 天狼猩红染色：在普通显微镜下,Control组大鼠主动脉胶原纤维均匀纤细,血管周围有极少量胶原；偏振光显微镜下,Control组大鼠主动脉中膜未见明显显色,外膜以Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维为主。在普通显微镜下,DM组大鼠主动脉间质胶原纤维明显增多,迂曲,排列紊乱,断裂明显增多；偏振光显微镜下,DM组大鼠主动脉中膜和外膜Ⅰ型及Ⅲ型胶原明显增加,胶原纤维断裂明显。半定量分析结果显示,与Control组大鼠相比,Chow+STZ组、HF组、DM组大鼠主动脉管周胶原面积/管腔面积(PVCA/LA)均有明显增加,差异具有统计学意义(0.06±0.0029vs.0.03±0.0015,P<0.001；0.04±0.0016vs.0.03±0.0015,P<0.05；0.10±0.007vs.0.03±0.0015,P<0.01),中膜胶原比例均有明显增加,差异具有统计学意义(4.42±0.48vs.1.12±0.14,P<0.001；2.45±0.22vs.1.12±0.14,P<0.01；5.70±0.31vs.1.12±0.14,P<0.001)；与HF组大鼠相比,Chow+STZ组、DM组大鼠主动脉中膜胶原比例及管周胶原面积/管腔面积(PVCA/LA)均有明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01～0.001)；与Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠主动脉管周胶原面积/管腔面积(PVCA/LA)有所增加,差异具有统计学意义(P<0.05)；与Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠主动脉中膜胶原比例有所增加,但差异没有统计学意义。 (3)Verhoeff弹力纤维染色显示：Control组大鼠主动脉弹力纤维分布均匀、整齐,完整无断裂；DM组大鼠主动脉弹力纤维迂曲,排列紊乱、疏松,分布欠均匀,可见明显断裂。半定量分析结果显示,与Control组大鼠相比,Chow+STZ组、HF组、DM组大鼠主动脉中膜弹力纤维比例均明显降低,差异具有统计学意义(5.19±0.76vs.11.96±0.75,P<0.001；8.83±0.98vs.11.96±0.75,P<0.05；4.70±0.36vs.11.96±0.75,P<0.001)；与HF组大鼠相比,DM组大鼠主动脉中膜弹力纤维比例明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；与Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠主动脉中膜弹力纤维比例略有降低,差异没有统计学意义。与Control组大鼠相比,Chow+STZ组、HF组、DM组大鼠主动脉胶原/弹力纤维比值均明显增加,差异具有统计学意义(0.57±0.09vs.0.05±0.007,P<0.01；0.17±0.0024vs.0.05±0.007,P<0.01；0.71±0.075vs.0.05±0.007,P<0.001)；与HF组大鼠相比,Chow+STZ组、DM组大鼠主动脉胶原/弹力纤维比值均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05～0.001)；与Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠主动脉胶原/弹力纤维比值略有增加,差异没有统计学意义。与Control组大鼠相比,Chow+STZ组、HF组、DM组大鼠主动脉平均主动脉壁结构积分均明显增加,差异具有统计学意义(P均<0.001)；与HF组大鼠相比,Chow+STZ组、DM组大鼠主动脉平均主动脉壁结构积分均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01、0.001)；与Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠主动脉平均主动脉壁结构积分略有增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。 (4)采用羟脯氨酸法测定大鼠主动脉胶原含量。结果显示：与Control组相比,Chow+STZ组、HF组、DM组大鼠主动脉胶原含量均明显增加,差异具有统计学意义(13.34±0.37vs.7.01±0.21ug/mg血管干重,P<0.001；8.47±0.21vs.7.01±0.21ug/mg血管干重,P<0.01；15.34±0.47vs7.01±0.21ug/mg血管干重,P<0.001)；与HF组大鼠相比,Chow+STZ组和DM组大鼠主动脉胶原含量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.001)；与Chow+STZ组大鼠相比,DM组大鼠主动脉组织胶原含量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.001)。 (5)免疫组化结果显示：与Control组相比,Chow+STZ组大鼠主动脉collagen Ⅰ、collagen Ⅲ阳性表达明显增多,HF组大鼠主动脉内collagen Ⅰ、collagen Ⅲ表达有所增加,DM组大鼠主动脉collagen Ⅰ、collagen Ⅲ阳性表达显著增多；与HF组相比,Chow+STZ组、DM组大鼠主动脉内collagen Ⅰ、collagen Ⅲ阳性表达均明显增多；与Chow+STZ组相比,DM组大鼠主动脉collagenⅠ、collagen Ⅲ阳性表达均明显增多。 (6)Collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的Western blot结果显示：与Control组相比,Chow+STZ组大鼠主动脉collagen Ⅰ、collagen Ⅲ蛋白表达明显增加,差异具有统计学意义(collagen Ⅰ:0.82±0.05vs.0.51±0.05,P<0.001：collagen Ⅲ:0.62±0.03vs.0.31±0.02,P<0.001),HF组主动脉collagen Ⅰ、collagen Ⅲ蛋白含量略有增加,差异具有统计学意义(collagen Ⅰ:0.60±0.03vs.0.51±0.05,P<0.01；collagen Ⅲ：0.47±0.03vs.0.31±0.02,P<O.05),DM组大鼠主动脉collagen Ⅰ、collagen Ⅲ蛋白表达显著增加,差异具有统计学意义(collagen Ⅰ:1.04±0.06vs.0.51±0.05,P<0.001；collagen Ⅲ:0.95±0.04vs.0.31±0.02,P<0.001)；与HF组大鼠相比,Chow+STZ组大鼠主动脉collagen Ⅰ、collagen Ⅲ蛋白表达明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01～0.001),DM组大鼠主动脉collagen Ⅰ、collagen Ⅲ蛋白表达明显增加,差异具有统计学意义(P<0.001)；与Chow+STZ组大鼠比较,DM组大鼠主动脉collagen Ⅰ、collagen、Ⅲ蛋白表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。 (7)与Control组相比,Chow+STZ组大鼠主动脉TRIB3蛋白表达量增加了1.33倍,差异具有统计学意义(P<0.001),HF组大鼠主动脉TRIB3蛋白表达量增加了72%,差异具有统计学意义(P<0.001),DM组...