油茶种子EST文库构建及油脂合成关键酶基因的分离鉴定

油茶(Camellia oleifera A.)是我国重要的木本食用油料树种，栽培面积大，分布广，适应性强。茶油中富含90％油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，是一种优质食用植物油，其副产品也有重要的用途，如枯饼可以提取皂素。茶树除具有经济价值外，在我国南方还具有重要的生态功能。到目前为止，国内外对油茶分子生物学研究很少，特别是对控制不饱和脂肪酸合成相关的重要基因的研究方面是一个空白。我们用近成熟的油茶种子为材料，构建了油茶种子的cDNA文库，在此基础上构建了EST文库并对油茶脂肪酸合成的关键基因等进行了分离鉴定工作。主要研究结果如下： 1．首次成功地构建了油茶种子油脂转化高峰期的cDNA文库。采集油茶优良无性系湘林1号和湘林4号的近成熟种子，采用裂解法提取总RNA，用磁珠法分离mRNA后，SuperScript Ⅱ合成第一链，第二链合成后进行未端补平、加接头、酶切、回收cDNA和重组cDNA，与载体pBluescript Ⅱ载体连接，最后将质粒转入大肠杆菌，成功地构建了油茶种子油脂转化高峰期的cDNA文库。经检测库容量达10～6以上，可满足EST构建和基因分离等工作的需要。 2．构建了油茶种子EST文库，并对近成熟种子的基因表达进行了初步分析。随机挑取2327个克隆，进行3’端单向cDNA测序，构建了油茶种子的EST文库。网络核酸数据库同源性比对的结果表明：有580个克隆与NCBI的NR库和dbEST库中的其它物种cDNA有很高的同源性；按照编码蛋白或酶的功能将油茶种子EST分为贮藏蛋白基因、脂肪酸合成等代谢基因、抗病、抗逆性基因、与执行表达功能相关的基因、信号转导、及大量未知功能的基因等类型。对油茶种子进行聚类分析和绘制聚类图，经过比对并统计其表达丰度，不同基因的表达丰度不同，低丰度中有个别基因只有一个EST序列。植物种子的油体蛋白基因、贮藏蛋白质基因在种子中高丰度表达。油茶种子存在较多的遍在蛋白基因，它与蛋白质的降解有关；油茶种子中与脂肪酸、蜡代谢有关的主要基因有：FatB1基因、SAD基因、FAD2基因、FAD8基因、ACP基因。此外油茶种子还有重金属解毒蛋白基因；参与肽链折叠的蛋白因子基因、肌动蛋白基因、脱落酸应答蛋白基因，与植物激素合成有关的基因如果实成熟的ACCase基因、种胚的形成和种子的发育基因等，并发现还有许多未知功能的基因。 3．首次成功地分离鉴定了油茶种子FAD2基因、SAD脱饱和酶基因、Oleosin基因和ACP等基因。所测FAD2基因cDNA序列与GenBank数据库同源性比较结果表明：油茶FAD2序列与油桐、欧洲油菜、向日葵、芝麻、拟南芥、花生、棉花基因序列和氨基酸序列比较有很高同源性，相似性系数分别为：96％、88％、 中南林学院博士学位论文油茶种子EST文库构建及油脂合成关键酶基因的分离鉴定 88%、88%、87%、61%、6%，与千年桐相似性系数达96%，同源性最高;但不同油 料植物的FADZ的cDNA序列除了相对保守的序列外，还存在不同的部分，都有各 自的特点，经过重复测序、双向测序，生物信息学分析后确认油茶FADZ是一个 新基因，并保存了相应的克隆菌株。SAD基因的CDNA序列经GenBank的NR库和 dbEST数据库比对，结果表明:SAD基因序列都有很高的同源性，相似系数>60%。 油茶SAD基因 CDNA序列与其它物种同源性比较结果:相似性系数按从大到小进 行排序为:向日葵、黄瓜(82%)>芝麻、鳄梨(79%)>普通油橄榄、马铃薯(78%) >大豆(77%)>陆地棉(4%)。经过重复测序、双向测序后确认为SAD基因，它是 油茶中的脂肪酸合成关键基因之一，也是一个新的基因。采用与分离SAD基因、 FAD基因相同的方法首次分离鉴定了油茶oleosin油体蛋白基因cDNA序列 oleosin油体蛋白基因是油茶种子中特异性表达的基因，且是高丰度表达，有15 条序列，占测序总数的0.6%，其cDNA序列与芝麻、紫苏、向日葵、野油橄榄和 胡萝卜相似性系数分别为87%、84%、82%、77%和18%，与芝麻相似性系数是87%， 油茶的Oleosin基因与芝麻的Oleosin基因同源性最大，经过重复测序、双向测 序后确认为Oleosin基因。首次分离鉴定了油茶种子的ACP基因cDNA序列，其 ACP基因cDNA序列与芫萎、辣椒、拟南芥、普通油橄榄、棉花、披针愕距花和 鹰嘴豆ACP基因的相似性按从大到小排序为66%、46%，45%、44%、42%、39%和 36%。其中与芫姜ACP一1的cDNA相似性最高为66%、与鹰嘴豆(cz’cerarjetjD姗) 的ACPI基因cDNA相似性最低为36%，经过重复测序、双向测序后确认为ACP基 因。对FADZ基因和SAD基因组研究取得了预期结果。依据同源性比较和cDNA序 列研究结果，找出FADZ基因保守区，并参照油菜等植物FADZ的引物，自行设计 引物由上海生工合成，从基因组DNA中扩增出FADZ基因目的片断并获得了相应 的序列;同样从基因组DNA中扩增出SAD基因目片断。 综上所述，通过构建油茶种子cDNA文库、EST文库和油脂合成过程中的关 键酶基因的分离鉴定等工作，填补了油茶基因和基因组研究的空白，研究结果为 今后油茶的分子生物学的研究提供了强有力的物质基础和信息资源，对于油茶所 有优质基因的保存和进一步的基因组研究、重要基因全长克隆和利用、油茶种子 发育阶段的时空表达研究，同时为油茶的基因芯片研制及植物油脂基