胶原性关节炎大鼠及人滑膜细胞β-arrestins的表达及白芍总苷和芍药苷的作用

目的:观察胶原性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）大鼠滑膜细胞β-arrestin1、β-arrestin2的表达以及白芍总苷（total glucosides of paeony , TGP）体内给药、芍药苷（paeoniflorin,Pae）体外给药后β-arrestin1、β-arrestin2表达的变化情况;人滑膜细胞经IL-1β刺激后β-arrestin1、β-arrestin2的表达变化及Pae的作用;并进一步探讨β-arrestin2与胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）的关系,以深入探讨类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）的发病机理和TGP治疗RA的药理作用机制。 方法:采用CCⅡ足趾、尾根部和背部皮内多点注射并一周后加强免疫法诱导大鼠CIA模型,TGP（25、50、100mg·kg-1·d-1）、雷公藤多苷（glucosides of tripterygium wifordii,GTW）(40 mg·kg-1·d-1)灌胃给药（intragastric injection administration, ig）(d14d28),检测足爪肿胀度;血清CⅡ抗体浓度变化;MTT法检测滑膜细胞的增殖;Western blot法检测β-arrestins在疾病进程中的表达变化和不同剂量TGP体内给药对β-arrestins表达的影响。 d28 CIA大鼠滑膜组织进行原代培养,取第3代滑膜细胞Pae（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1）体外给药,Western blot法检测不同浓度Pae体外给药对β-arrestins表达的影响。 收集行髋关节置换术患者滑膜组织,经知情同意,采用组织块培养法对人滑膜细胞进行培养,取3代滑膜细胞,IL-1β刺激,观测刺激后不同时间点cAMP、PKA、β-arrestins的变化及Pae的作用;使用ERK抑制剂U0126观察对β-arrestin2表达的影响。 结果: 1. CIA大鼠滑膜组织中β-arrestin1和β-arrestin2的表达情况 CIA大鼠致敏后,滑膜组织β-arrestin1表达水平变化无显著性;而β-arrestin2表达水平于致敏后d14显著升高,d28表达达到峰值,d35仍高于正常组水平,与炎症的发展过程相一致,提示β-arrestin2在RA发病过程中起到了重要作用。 2.人滑膜细胞IL-1β刺激后不同时间点cAMP、PKA、β-arrestin2的变化 取3代滑膜细胞,于IL-1β刺激后2h、4h、8h、16h、24h,检测cAMP水平、PKA活性,4h时cAMP显著升高,8h后下降,24h时显著降低;PKA活性于4h时显著升高,随后渐恢复至正常水平。 取3代滑膜细胞,于IL-1β刺激后0、3h、6h、12h、24h、48h检测?-arrestin2的表达,于12h表达开始升高,24h达到峰值。 取3代滑膜细胞,加入U0126（25μM,50μM）或其溶媒培养2h后,加入IL-1β（终浓度10ng·ml-1）培养24小时,U0126（25μM,50μM）能明显减少β-arrestin2的表达。 3. TGP对大鼠CIA的治疗作用及TGP和Pae对β-arrestins表达的影响 TGP （25、50、100mg·kg-1, ig, d14d28）可明显减轻CIA大鼠多发性关节炎评分。CIA大鼠血清CII抗体水平显著升高,TGP（25、50、100mg·kg-1, ig, d14d28）能明显降低CII抗体浓度。CIA大鼠关节病理可见明显炎症表现,TGP三个剂量组可不同程度的抑制关节炎症。CIA大鼠成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）增殖反应增强,TGP（50、100mg·kg-1, ig, d14d28）可抑制FLS增殖反应。 取致敏d28 CIA组及TGP各用药组大鼠滑膜组织,Western blot法检测β-arrestin1和β-arrestin2表达水平,发现TGP（50、100mg·kg-1, ig, d14d28）能明显减少致炎后β-arrestin2的表达,对β-arrestin1表达水平影响无显著性。 d28 CIA大鼠处死后进行滑膜细胞培养,取3代滑膜细胞检测发现β-arrestin2表达显著升高,Pae（10-5、10-6、10-7 mol·L-1）体外给药能明显减少β-arrestin2的表达。 人滑膜细胞经传代培养后取3代滑膜细胞,加入Pae（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol·L-1）作用后加入IL-1β刺激24h,与未用药组相比,Pae（10-5、10-6、10-7 mol·L-1）能明显减少β-arrestin2的表达。 结论: 1. CIA大鼠滑膜组织中β-arrestin2的表达水平随着病程发展而升高,与炎症的发展过程相一致。 2.人滑膜细胞经IL-1β刺激后,β-arrestin2的表达上调,这可能是引起G蛋白偶联受体信号转导过度脱敏,滑膜细胞增殖的机制之一;ERK抑制剂U0126（25μM,50μM）能减少IL-1β刺激后β-arrestin2的表达,这可能与ERK的活化能促进β-arrestin2表达有关。 3. TGP能明显降低CIA大鼠多发性关节炎指数,降低CII抗体浓度,抑制滑膜细胞的增殖反应,可以下调滑膜组织中异常升高的β-arrestin2表达;芍药苷体外用药同样能下调CIA大鼠及IL-1β刺激后人滑膜细胞中β-arrestin2的表达。下调β-arrestin2的表达,改善G蛋白偶联受体信号转导的过度脱敏可能是TGP抑制滑膜细胞增殖的机制之一。