第一部分AGEs对兔软骨细胞TNF-a和MMP-13表达的影响与意义
目的：以外源性晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)为损伤因子,在体外培养的家兔软骨细胞模型上,观察AGEs对肿瘤坏死因子-a (tumor necrosisfactor-a,TNF-α)和基质金属蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase 13, MMP-13)的表达和影响,探讨AGEs与骨关节炎(Osteoarthritis, OA)的关系及可能的信号通路及机制。
方法：在原代培养的家兔软骨细胞模型上,(1)不同浓度的AGEs与软骨细胞共孵育48h后检测软骨细胞TNF-a和MMP-13 mRNA的表达情况；(2)AGEs受体(Receptor for advanced glycation end products, RAGE)的抗体(anti-RAGE)及核因子，B (nuclear factor-KB, NF-κB)的特异性阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)与软骨细胞预孵12h后,再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h,检测软骨细胞TNF-a及MMP-13mRNA的表达；(3)不同浓度的AGEs与软骨细胞共孵育48h后检测软骨细胞过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。采用RT-PCR方法检测TNF-α和MMP-13的mRNA表达量,试剂盒方法检测CAT、SOD活性及MDA水平,荧光探针法检测ROS水平。
结果：(1)不同浓度的AGEs (1,10,25,50,100μg/ml)与软骨细胞共孵育48h后,TNF-a及MMP-13mRNA的表达较正常对照组明显升高(P<0.05或P<0.01),且均以AGEs浓度为100μg/ml时作用最明显；(2)Anti-RAGE (5μg/ml)与PDTC(0.1mmol/L)能显著抑制由AGEs (100μg/ml)诱导的软骨细胞TNF-α及MMP-13表达增多(P<0.01),而anti-RAGE (5μg/ml)和PDTC(0.1mmol/L)单独处理组与正常对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)；(3)不同浓度的AGEs (1,10,25,50,100μg/ml)与软骨细胞共孵育48h后,浓度依赖性地使软骨细饱CAT、SOD活性降低, MDA、ROS含量增多,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)
结论：AGEs能显著刺激软骨细胞TNF-α和MMP-13表达增多,诱导软骨细胞损伤,其机制与激活RAGE,诱导活性氧(ROS)生成增多,激活NF-κB信号通路有关。
第二部分AGEs对兔软骨细胞PPARγ表达的影响与机制
目的：在体外培养的家兔软骨细胞模型上,观察AGEs对软骨细胞过氧化物酶体增生物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPARγ)表达的影响,探讨AGEs与PPARγ的关系与机制。
方法：在原代培养的家兔软骨细胞模型上,(1)不同浓度的AGEs与软骨细胞共孵育48h后检测软骨细胞PPARγ的表达情况；(2)软骨细胞与AGEs共孵育不同时间后检测软骨细胞PPARγ的表达情况；(3) RAGE的抗体(anti-PAGE)与软骨细胞预孵1h后,再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h,检测软骨细胞PPARγ的表达情况；(4)不同浓度的丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号路径的阻断剂(P38-MAPK阻断剂SB203580,JNK-MAPK阻断剂SP600125,ERK-MAPK阻断剂PD98059)与软骨细胞预孵30min,再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h,检测软骨细胞PPARγ的表达情况。用RT-PCR方法检测PPARγ的mRNA水平,用Western blot方法检测PPARγ的蛋白含量。
结果：(1)不同浓度的AGEs (1,10,25,50,100μg/ml)与软骨细胞共孵育48h后,软骨细胞PPARγ的mRNA水平及蛋白含量较正常对照组明显降低(P<0.05),AGEs浓度越高PPARγ的mRNA水平及蛋白含量越低；(2)软骨细胞与100μg/ml AGE共孵育不同时间(0,3,6,12,24,48h)后,PPARγ的mRNA表达和蛋白含量均随时间的延长而降低,0h处理组与其他各组比较PPARγ的mRNA表达和蛋白含量差异均有统计学意义(P<0.05)；(3)Anti-RAGE (5μg/ml) +AGEs处理组软骨细胞PPARγ的mRNA表达显著高于AGEs (100μg/ml)处理组(P<0.05)；(4) P38-MAPK阻断剂SB203580+AGEs和JNK-MAPK阻断剂SP600125+AGEs处理组的软骨细胞PPARγ的mRNA水平及蛋白含量明显高于AGEs单独处理组(P<0.05),阻断剂浓度越高PPARγ的mRNA水平及蛋白含量越高；ERK-MAPK阻断剂PD98059+AGEs处理组与AGEs单独处理组比较,软骨细胞PPARγ的mRNA水平及蛋白含量均无明显差异(P<0.05)
结论：1.AGEs可诱导软骨细胞PPARγ表达下调,并具有浓度和时间依赖性；2.AGEs通过AGEs-RAGE-MAPK途径实现对软骨细胞PPARγ表达下调；3.MAPKs家族中P38-MAPK和JNK-MAPK信号通路参与了AGEs诱导软骨细胞PPARγ表达下调,ERK-MAPK信号通路与该效果无关。
第三部分PPARγ激动剂对AGEs诱导兔软骨细胞TNF-α和MMP-13表达的影响与机制
目的：在体外培养的家兔软骨细胞模型上,观察PPARγ激动剂吡格列酮(pioglitazone)对AGEs诱导兔软骨细胞TNF-a和MMP-13表达的影响,进一步探讨PPARγ表达下调在AGEs致骨关节炎的作用、机制与意义。
方法：在原代培养的家兔软骨细胞模型上,不同剂量的吡格列酮(1,10,50μM)与软骨细胞预孵2h后,再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h, (1)RT-PCR方法检测软骨细胞TNF-α和MMP-13的mRNA水平,用Western blot方法检测TNF-α和MMP-13的蛋白含量；(2)试剂盒方法检测软骨细胞CAT、SOD活性及MDA水平；(3)荧光探针法检测软骨细胞ROS水平；(4)免疫荧光染色法检测软骨细胞的NF-κB-p65亚基转运情况。
结果：(1)不同剂量的吡格列酮(1,10,50μM)+AGEs处理组软骨细胞TNF-α和MMP-13mRNA水平及蛋白含量明显低于AGEs处理组(P<0.05),吡格列酮剂量越大TNF-α和MMP-13mRNA水平及蛋白含量越低,50μM匹格列酮+AGEs处理组及50μM匹格列酮单独处理组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；(2)1、10、50 u M口比格列酮与软骨细胞预孵育1h后,浓度依赖性的拮抗由AGEs所致软骨细胞CAT、SOD活性降低及MDA、ROS水平增高(P<0.05),且均50μM毗格列酮作用最明显；(3)1、10、50μM吡格列酮与软骨细胞预孵育1h后,再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h,软骨细胞NF-κBP65的核转位呈浓度依赖性明显抑制,100μg/mlAGEs单纯处理组则明显高于正常对照组(P<0.05)。
结论：1.存在一条AGEs诱导软骨细胞TNF-a和MMP-13表达增多的信号通路,即：AGEs→RAGE→ROS↑→激活MAPK (P38-MAPK和JNK-MAPK)→下调PPARγ→F-κB活化→TNF-a和MMP-13↑; 2. PPARy下调在AGEs诱导软骨细胞TNF-a和MMP-13表达增多的信号通路中起到了重要作用；3.PPARy激动剂吡格列酮能显著抑制AGEs诱导软骨细胞TNF-a和MMP-13表达增多；4.吡格列酮通过抑制RAGE/ROS/NF-κB信号通路,抵抗AGEs所致软骨细胞损伤,从而起到防治骨关节炎病变的作用；5. AGEs致骨性关节炎病变可能存在以下细胞内信号传导途径：AGEs与RAGE结合→氧自由基↑→激活MAPK→下调PPARy→细胞内信号转导使NF-κB活化→一系列炎症和损伤因子表达→软骨损伤。
