云芝多糖分离、纯化、药理活性及其作用机制研究

云芝[Trametes versicolor（L．：Fr．）Pilát]是一种世界性分布的药用真菌，性微甘、寒，能清热、消炎，主治气管炎、肝炎、肿瘤等，近代人们对云芝的药用价值的研究主要是以民间经验为依据，随着研究的不断深入，研究水平的不断提高，应用范围的扩大，提出了云芝具有扶正固本、补益精气的功效的补充定位。由于云芝具有的生态型种类，吉林省就可初分为14个型，在商品云芝中存有10余种误用品，常见的有6种，对云芝的有效性、安全性应用产生一定的影响。云芝多糖过于广泛的药理活性，也引起人们的关注，而有些药理活性在其它植物菌物的糖活性方面从未见过报道，或很少有报道，可能会对云芝的药用价值的科学性产生误导，特此对云芝及其多糖的药理活性进行客观、深入、系统的研究，使人们对云芝及多糖的活性有一个清醒的认识，达到正本清源的目的这是十分必要的。 通过文献的查阅、整理、分析，归纳出云芝生物特性及有效的鉴别指标，吉林省长白区生长的14个类型的云芝在微细结构方面相互间没有明显差异，主要表现在外部形态的差异上。造成外部形态的差异主要是由于其长生环境的不同的影响，主要影响因素有营养条件，水分温度、光照等。鉴别云芝的主要依据有三点：1、盖面上的云纹状环带具有2-3种以上的绒毛；2、子实层呈管状，老熟后部分管口发生齿裂，3、管口面初期呈白色，渐变为黄褐色。文献报道用于试验研究的云芝多糖样品具有多种来源和处理方法，其实不外于两种类型。即云芝子实体多糖（CVPS）、云芝菌丝体多糖（PSK、PSP）多为含有结合蛋白质或多肽、游离蛋白质或多肽以及含有其它小分子等的粗多糖，其纯度不高，有些活性试验可能会受到多糖以外的成分的影响，造成一些尚不十分清晰的结论，缺乏系统性，对比性的研究。 通过提取多糖工艺的正交实验设计、选择较合理的工艺条件，并在原有的传统工艺基础上进行进一步纯化，得到纯度相对较高（80％以上），并不含小分子物质的云芝多糖（CVPS），收率为6.12-7.68％。通过进一步的纯化、分离，得到其中含量较高的均一多糖P-I（占全组分多糖的80.6％），其分子量为39KD。主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、岩澡糖及少量的鼠李糖组成，其摩尔比为5.93：2.20：0.90：1.26：0.81：0.43。 通过对不同类型的实验性肝损伤动物模型，腹腔注射25-100mg／kg时呈现明显的保护作用，而灌胃给药CVPS人的研究在25-400mg／kg范围内，对几种实验性肝损伤未见明显的保护作用。 对经过蛋白酶消化以后的云芝多糖表现出对小鼠脾细胞具有直接的增殖作用，活性与胃蛋白酶处理比较并未有明显的减弱。且在31.25-125μg／mg剂量范围内呈现明显的量效关系。对小鼠T、B淋巴细胞的增殖作用也无明显影响，对小鼠腹腔的吞噬功能也无明显影响。 对经过高碘酸盐NaIO4（periodate oxidation）处理后的CVPS表现出对小鼠 吉林农业大学博士学位论文 云芝多糖分离、纯化、药理活性及其机制研究 脾细胞直接增殖作用，对小鼠T、B淋巴细胞的增殖以及小鼠腹腔巨噬细胞的吞 噬功能的活性有明显影响，活性显著下降。 对nNeB、s咫e两种实验动物变态反应（hypersensitivity）性免疫异常增 高病理模型具有明显增强作用，并可以部分拮抗CY的免疫（immuno）抑制作 用。 进一步的研究表明在离体条件下，通过建立培养小鼠脾淋巴细胞模型.CvPs 在浓度31.25一250林g/ml范围内，可以直接刺脾激淋巴细胞的增殖，本身既存在 有丝分裂原样作用，且在125一31.25林g/ml浓度范围内具有明显的量效关 系.cvPs对conA和LPs诱导的T、B淋巴细胞增殖有明显促进作用。而且与诱导 剂ConA和LPS有协同作用，CY在0.02林g/ml对T.B淋巴细胞有明显的抑制作用， 在31.25一500林g/m1浓度范围内，cvPs可明显增加小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功 能，呈现出剂量依赖相关性，且高剂量组吞噬率达到 83.51%。cvPs明显拮抗Mitc 抑制细胞生长作用。且呈现出剂量相关性。CvPS又明显增强小鼠NK细胞对K562 白血病细胞的杀伤作用。并能明显促进小鼠混合淋巴细胞的反应。在75一30。“ g/m1浓度范围内cvPs对40倍及60倍稀释IL一1的活性均有明显增强作用，对 各不同稀释度的工L一2活性也有明显的增强作用。对INF杀伤L，29肺上部肿瘤细 胞、cvPs在31.25一250料g/ml浓度范围内有明显的量效关系。对混合淋巴细胞 反应MLR也有明显的增强作用。CvPS直接与免疫细胞培养，可以产生非常明显 的免疫增强作用。 另一方面，通过整体给药进一步研究了cvPS对上述免疫相关因子活性的影 响。腹腔注射cvPs，在25一100林g/kg剂量范围内对上述免疫细胞、细胞因子仍 然表现出较强的免疫增强作用，从而表现出CVPS在注射给药条件下，其免疫增 强活性受体内环境影响不大。云芝多糖免疫增强作用是其最重要的药理作用，主 要通过促进细胞因子的生成，激活M。，NK细胞，T、B淋巴细胞以诱生IFN一Y 等途径实现。