双水杨酸酯通过调节ZDF大鼠肠道菌群紊乱预防2型糖尿病的实验研究

目的:由于糖尿病及其并发症治疗困难且造成的财政压力巨大,因此最新的指南要求糖尿病的管理重在早期预防。IGT(impaired glucose tolerance,糖耐量减低)期是进展至糖尿病的一个重要阶段,在此期进行干预可以延缓甚至逆转2型糖尿病的进展。近年来临床研究发现双水杨酸酯还有调节糖脂代谢紊乱的作用,但机制并不十分明确。目前大量研究发现肠道菌群的紊乱与2型糖尿病的发病密切相关。本研究使用自发2型糖尿病模型——ZDF大鼠作为研究对象,从IGT期开始予小剂量(50mg/kg.d-1)双水杨酸酯(salsalate,SAL)进行干预,观察双水杨酸酯对血脂、血糖的改善作用和肠道菌群多样性及不同分类水平上菌群丰度的改善情况,初步探讨双水杨酸酯调节肠道菌群紊乱、预防2型糖尿病的可能机制。方法:1.以ZDF大鼠为研究对象,同周龄的ZL大鼠作为同品系的正常对照组(简称“正常组”)。每周行OGTT,根据血糖值将不同周龄的ZDF大鼠分为NGT(normal glucose tolerance,糖耐量正常)期、IGT期、糖尿病(diabetes,DM)期3个阶段。在IGT期将ZDF大鼠分为模型组和SAL干预组,干预组每日给予双水杨酸酯(50mg/kg.d-1)灌胃。留取不同周龄大鼠的血、尿、便及回肠组织。2.生化法检测大鼠甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的水平。3.ELISA法检测不同周龄大鼠空腹胰岛素、空腹胰高血糖素的水平,并计算HOMA-IR指数。4.生化法检测不同周龄大鼠肝、肾功能及24h尿蛋白水平的变化。5.16S rDNA焦磷酸测序技术检测不同周龄大鼠肠道菌群多样性及不同分类水平上的相对丰度。6.光镜、电镜观察不同周龄大鼠回肠形态结构。免疫组织化学染色法检测回肠紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin)的表达量。7.ELISA法测定回肠组织上清液中脂多糖(LPS)水平,免疫荧光法检测大鼠回肠巨噬细胞M1、M2的表达量,RT-PCR法检测回肠组织M1、M2型巨噬细胞相关mRNA(IL-1、IL-4、IL-10、IL-12、iNOS、Arg-1)的表达量。免疫组化法检测TIL4、NFкB、TNFα的表达量。结果:一、双水杨酸酯对ZDF大鼠糖脂代谢的干预效果1.9周龄时,20只ZDF大鼠全部发生糖耐量异常。12周龄时,ZDF模型组大鼠(10只)100%发生糖尿病,而双水杨酸酯干预组(10只)仅有1只符合IGT的诊断,其余9只糖耐量均恢复至正常糖耐量。2.NGT期、IGT期、DM期ZDF大鼠的葡萄糖曲线下面积均高于ZL大鼠(P﹤0.05)。DM期(12周龄)SAL干预组葡萄糖曲线下面积低于同周龄模型组(P﹤0.05),与正常对照组相比无统计学差异(P﹥0.05)。DM期模型组胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白高于正常组(P﹤0.05),SAL干预组胆固醇、高密度脂蛋白水平低于模型组(P﹤0.05)。3.IGT期、DM期模型组大鼠的空腹胰岛素分泌量低于同周龄的正常对照组,而空腹胰高血糖素明显高于正常对照组(P﹤0.05)。12周龄时SAL干预组与模型组大鼠相比胰岛素分泌水平明显升高(7.5±0.4ng/m L vs.5.4±0.7ng/mL,P﹤0.05),而胰高血糖素较模型组明显减少(P﹤0.05)。IGT期、DM期ZDF模型组大鼠胰岛素抵抗指数均高于同周龄的ZL大鼠。12周龄时双水杨酸酯干预组胰岛素抵抗指数低于同周龄模型组(3.2±0.9 vs.5.6±2.0,P﹤0.05)。4.实验终止时(12周龄),全部双水杨酸酯干预组大鼠的肝肾功能、24小时尿蛋白与正常对照组、模型组相比均未见显著差异(P﹥0.05)。二、双水杨酸酯通过调节ZDF大鼠肠道菌群紊乱预防2型糖尿病发生的机制探讨1.菌群多样性变化:ZDF模型组大鼠随糖尿病病程的进展α多样性逐渐减少。ZL正常组大鼠在不考虑每个物种的丰度时,各个时期比较无统计学差异,但若考虑每个物种的丰富度,则DM期的物种多样性较前两期是减少的(P﹤0.05)。12周龄时双水杨酸酯干预组肠道菌群α多样性高于模型组(P﹤0.05)。在NGT期正常组与模型组的β多样性即存在差异。模型组大鼠随病程进展β多样性差异逐渐增大,12周龄时双水杨酸酯干预组菌群的β多样性与正常组相近。2.菌门水平比较:NGT期正常组大鼠的放线菌门的相对丰度较模型组大鼠高(P﹤0.05)。模型组大鼠随病程进展硬壁菌门、疣微菌门的相对丰度逐渐减少,拟杆菌门相对丰度逐渐增加。DM期模型组大鼠与正常组相比硬壁菌门、放线菌门、疣微菌门的相对丰度较低(P﹥0.05),双水杨酸酯干预组与正常组硬壁菌门、疣微菌门的相对丰度相比未见统计学差异(P﹥0.05)。3.菌属水平比较:NGT期正常组大鼠较模型组大鼠拟杆菌属、毛螺菌属、瘤胃球菌属、罗斯氏菌属相对丰度低,较ZDF大鼠乳酸杆菌属、双歧杆菌属丰度高。模型组大鼠随糖尿病进展拟杆菌属、梭菌属、瘤胃球菌、罗斯氏菌属、毛螺菌属、萨特菌属、Akkermansia属的相对丰度逐渐减少,普雷沃菌属相对丰度逐渐增高,而乳酸杆菌呈先增高后降低的趋势。DM期模型组大鼠较正常组普雷沃菌属的相对丰度高,而梭菌属、瘤胃球菌属、乳酸杆菌属、毛螺菌属、罗斯氏菌属、Akkermansia属的相对丰度低。干预组罗斯氏菌属相对丰度高于模型组(P﹤0.05)。4.肠道结构和功能的改变:回肠病理结果示模型组大鼠随糖尿病的进展肠上皮完整性,紧密连接、肠绒毛损伤逐渐加重,干预组肠道损伤较模型组轻。免疫组化染色示模型组大鼠肠粘膜紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达量较正常组减少。而干预组紧密连接蛋白表达量较模型组增加。5.肠道炎症指标的变化:IGT期、DM期模型组大鼠回肠上清液脂多糖(LPS)高于同周龄正常组,12周龄时干预组LPS水平低于模型组。12周龄时模型组大鼠回肠M1型巨噬细胞及其标志物mRNA表达量高于正常组,M2型巨噬细胞及其标志物mRNA表达量低于正常组,干预组M1型巨噬细胞及其标志物表达量低于模型组而M2型巨噬细胞及其标志物mRNA表达量高于模型组。结论:1、小剂量双水杨酸酯早期干预可改善ZDF大鼠的糖脂代谢,促进其胰岛素分泌,减少其胰高血糖素分泌,改善胰岛素抵抗,有效预防2型糖尿病的发生。2、双水杨酸酯可通过调节肠道菌群紊乱发挥预防糖尿病的作用,其可能作用机制:双水杨酸酯通过调节肠道菌群紊乱减少LPS的产生,保护肠道的结构和功能,防止LPS进入体内,减少巨噬细胞的极化,进而减少炎性因子的产生,促进抑炎因子的生成,改善慢性炎症状态,预防2型糖尿病的发生。3、小剂量双水杨酸酯预防2型糖尿病具有较好安全性。