掌叶半夏有效提取物对宫颈癌细胞株的抑制作用及其机制研究

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,我国每年宫颈癌的新发病例数和死亡人数均居世界的前列。近年来随着人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,简称HPV)感染率的升高,子宫颈癌的发病率呈明显上升趋势,而且高发年龄趋于年轻化,成为严重危害女性健康的疾病。 传统中药掌叶半夏(Pinellia pedatisecta schott)系天南星科半夏属掌叶半夏的块茎,产于我国大部分地区。上世纪七十年代,上海第一医学院妇产科医院(即现今的复旦大学附属妇产科医院)曾用掌叶半夏治疗子宫颈癌247例,初步证实了它的有效性、低毒性和安全性。但对该药的药理机制未进行过深入的研究。本课题拟在前期临床研究工作和现有文献的基础上,首次利用中科院上海药物所应用现代工艺提取的掌叶半夏有效提取物(Pinellia Extract,简称PE),观察其对体外培养的宫颈癌细胞株的作用,并研究可能的作用机制,希望为临床HPV感染以及宫颈癌癌前病变的辅助治疗寻求一种新的途径,最终预防宫颈癌的发生。 全文共分三个部分:1.PE对宮颈癌细胞株CaSki和HeLa的增殖抑制作用研究;2.PE对宫颈癌细胞株CaSki和HeLa的促凋亡作用研究;3.PE对宫颈癌细胞株CaSki和HeLa HPV E6及P53表汰的影响。 第一部分PE对宫颈癌细胞株CaSki和HeLa的增殖抑制作用研究 目的了解PE对宫颈癌细胞株CaSki和HeLa细胞增殖的影响,并研究可能的作用机制。 方法在宫颈癌细胞株CaSki和HeLa的培养基中加入PE,采用MTT比色法检测不同浓度PE作用不同时间对CaSki和HeLa细胞增殖的影响,同时观察PE对HeLa细胞对顺铂(DDP)敏感性的影响。采用倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜观察CaSki和HeLa细胞经0.15mg/mL的PE作用后,细胞形态学和超微结构的变化。免疫细胞化学实验检测PE作用24小时后CaSki和HeLa细胞PCNA的表达变化;用In-cellWestern Blot方法检测不同浓度PE作用于CaSki和HeLa细胞15分钟后,磷酸化ERK的表达变化。 结果PE可抑制宫颈癌细胞株CaSki和HeLa的增殖,且抑制作用具有良好的时间和剂量依赖效应:同时发现低剂量PE可增强DDP对HeLa细胞的抑制作用。倒置相差显微镜下观察到PE作用后细胞出现皱缩并呈悬浮状态生长,进一步用扫描电镜和透射电镜观察发现PE作用后细胞表面的微绒毛明显减少,核固缩、胞浆空泡增多,出现凋亡表现。PE作用24小时后CaSki和HeLa细胞PCNA的表达明显下降;不同浓度PE作用于CaSki和HeLa细胞15分钟后,两种细胞磷酸化ERK的表达都出现不同程度的下降,并具有剂量依赖效应,即PE浓度越大,两种细胞磷酸化ERK的表达越低。 结论PE可以抑制人子宫颈癌细胞的增殖,对宫颈鳞癌和宫颈腺癌细胞株的抑制作用相似;同时PE可以提高HeLa细胞对顺铂的敏感性。PE抑制人子宫颈癌细胞增殖的作用机制包括抑制PCNA的表达、阻断MAPK/ERK信号转导通路。 第二部分PE对宫颈癌细胞株CaSki和HeLa的促凋亡作用研究 目的了解PE对宫颈癌细胞株CaSki和HeLa的促凋亡作用,并探讨可能的作用机制。 方法应用流式细胞仪检测PE作用不同时间后CaSki和HeLa的细胞凋亡和细胞周期的变化;用免疫荧光实验检测PE作用24小时后CaSki和HeLa细胞Bcl-2表达的变化。 结果流式细胞仪检测结果表明,1.15mg/mL的PE作用3天后CaSki和HeLa近半数细胞已经凋亡,作用5天后两种细胞的凋亡率高达70%以上,与对照组比较差异非常显著;而PE作用后两种细胞的细胞周期与对照组比较无明显区别。免疫荧光实验检测结果显示,0.15mg/mL PE作用24小时后,CaSki和HeLa细胞Bcl-2的表达均明显下降,与对照组比较差异显著。 结论PE可以促进宫颈癌细胞株CaSki和HeLa凋亡,且呈现时间依赖性;PE的促凋亡作用之一是通过降低Bcl-2的表达。 第三部分PE对宫颈癌细胞株CaSki和HeLa HPV E6及P53的影响 目的了解PE对宫颈癌细胞株CaSki和HeLa HPV E6及P53mRNA及蛋白表达的影响。 方法采用常规RT-PCR及Realtime RT-PCR检测PE作用24小时后宮颈癌细胞株CaSki和HeLa HPV E6及P53 mRNA的表达变化;采用Western blot检测PE作用24小时后宫颈癌细胞株CaSki和HeLa HPVE6及P53蛋白的表达变化。 结果常规RT-PCR及Realtime RT-PCR结果表明:0.1 5mg/mLPE作用于CaSki和HeLa细胞24小时后,P53mRNA表达水平明显增加,而HPV E6mRNA表达水平明显下降,与对照组比较差异非常显著;Western blot结果显示药物作用24小时后,两种细胞HPV E6蛋白的表达水平下降,与对照组比较差异显著,P53蛋白表达水平增加,但与对照组比较差异无统计学意义。 结论PE可以明显抑制宮颈癌细胞株CaSki和HeLa HPV E6mRNA和蛋白的表达;同时PE可以提高两种细胞P53 mRNA和蛋白的表达。这可能是PE抗宮颈癌的主要作用机制。