p204注射对斑马鱼胚胎发育和早期骨形成的影响

哺乳动物骨骼的发育经过了多步过程,包括早期骨的图式形成、间充质细胞分化为成骨细胞系和软骨细胞系、造血干细胞分化为破骨细胞系,以及前体细胞终末分化为三种类型的细胞,即软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞。成骨细胞的发生是一个非常复杂的过程,与多种信号通路相关,如TGF-p信号通路、Wnt信号通路、FGF信号通路、Hedgehog信号通路等。在这些信号通路中,转录因子Cbfa1/Runx2(core binding factor a 1)起关键作用,是成骨细胞分化和发生最重要的转录因子。 p204是小鼠干扰素诱导p200蛋白家族的成员之一,这一蛋白家族的成员通过与靶蛋白(包括转录因子,信号蛋白,肿瘤蛋白和肿瘤抑制因子)的结合来调节其活性,在细胞增殖和组织分化中起着重要的作用。已有研究表明,p204作为Cbfal蛋白的辅因子,以pRb为桥梁直接或间接结合到Cbfa1上促进骨的生长；p204、pRb与Cbfa1构成一个三元转录复合体促进Cbfa1下游骨发生相关基因(如ALP, OCL)的转录。 通过基因序列比对分析表明,在斑马鱼中存在runx2, pRb的同源基因,其中runx2的同源基因有两个,分别为runx2a和runx2b; runx2b在斑马鱼骨发生中起主要作用。已有研究表明,runx2b是一种母原型的基因,在1-cell期利用MO抑制其表达会导致斑马鱼胚胎的严重背部化。但未找到p204的同源基因,本课题以斑马鱼为模式动物主要研究外源基因p204在胚胎发育以及早期骨发生过程中的作用。 实验方法：(一)构建p204与GFP的融合蛋白表达载体。(二)将构建好的表达载体直接显微注射到斑马鱼1-cell胚胎中。(三)检测p204注射后对斑马鱼胚胎发育和早期骨形成的影响。1)在倒置显微镜下观察GFP的表达情况以指示p204基因的表达。2)通过real-time RT-PCR来检测几种斑马鱼背腹轴形成和骨分化相关基因表达水平的变化。3)原位杂交技术检测p204注射后runx2b的表达变化。 研究结果：1)p204注射诱导产生斑马鱼腹部膨大和脊柱弯曲的畸形。2)GFP观察结果表明,p204在斑马鱼胚胎发育的8hpf-8dpf均有大量的表达,但在11dpf之后表达几乎完全消失。3)real-time RT-PCR结果表明,在1dpf-3dpf,一些与斑马鱼背腹轴形成和骨分化相关的基因如vent, runx2b, osn等在注射前后表达水平发生变化。4)runx2b原位杂交结果显示,在p204注射后unx2b的表达量有明显上调,但其表达的空间位置变化不大。 结论：p204注射到斑马鱼胚胎后,可诱导产生斑马鱼腹部膨大的畸形,并引起了一些与斑马鱼背腹轴形成和骨分化相关的基因如vent, runx2b, osn等表达水平发生变化。本研究不仅发现了p204对斑马鱼胚胎发育的作用,而且为进一步阐明斑马鱼骨发生相关的分子机制提供了依据。